枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白CotC表面展示海藻糖合酶的技術(shù)研究.pdf

1、海藻糖是由兩分子葡萄糖通過半縮醛羥基縮合而成的，自然界中普遍存在的一種非還原性雙糖，是一種極好的天然干燥劑和保鮮劑。海藻糖合酶（ Trehalose synthase，TreS）屬于糖苷水解酶第13家族，能夠催化麥芽糖直接轉(zhuǎn)化為海藻糖，該酶在催化反應(yīng)中的底物特異性和專一性較高，不需要消耗高能物質(zhì)，是生產(chǎn)海藻糖的首選。
　　本研究選取增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）和海藻糖合酶（TreS）作為模型蛋白，首先以來自枯草芽孢桿菌的芽孢衣殼

2、蛋白Cot C、Cot B、Cot G、Cot X作為枯草芽桿菌表面展示的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白進(jìn)行表面展示研究。利用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡分析 EGFP在芽孢表面展示的情況，結(jié)果表明上述芽孢衣殼蛋白均可以將 EGFP固定在芽孢的表面。然后將熒光蛋白基因egfp通過酶切替換為海藻糖合酶基因tres，將重組菌株使用pH7.5的緩沖液清洗并重懸，與底物濃度為30％的麥芽糖在40℃水浴條件下作用2h，反應(yīng)產(chǎn)物利用HPLC檢測，能夠檢測到海藻糖峰，

3、說明海藻糖合酶基因通過與芽孢衣殼蛋白Cot C融合后可被展示在芽孢的表面。通過對(duì)重組菌的產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基在碳源、氮源和無機(jī)鹽方面的優(yōu)化，可知在添加量為2％的麩皮、2％的大豆蛋白胨、0.1％的CaCl2和0.002％的 MnSO4·H2O，在 pH7.5，40℃條件下芽孢形成率最高。根據(jù)優(yōu)化后的酶促反應(yīng)條件為pH7.5，40℃時(shí)，表面展示海藻糖合酶的酶活最高為27.2U/mL。40℃-45℃溫度范圍內(nèi)保溫6h其相對(duì)酶活在83％以上，在pH7.