N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶(GNE)基因的克隆、表達(dá)及抗體制備.pdf

1、目的： 1、由于酶法合成神經(jīng)氨酸具有很大的優(yōu)勢(shì)，我們利用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶(EC5.1.3.8)可以差向異構(gòu)化N-乙酰-D-葡萄糖胺，從而得到合成神經(jīng)氨酸的原料N-乙酰-D-甘露糖胺，故我們從豬腎中提取RNA從而克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶基因，并在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中表達(dá)、His-tag親和純化。 2、將純化的蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體。 方法

2、： 1、我們首先從豬腎中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶基因，經(jīng)測(cè)序，大腸桿菌E.coli DH5a感受態(tài)轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒抽提，鑒定以及大腸桿菌BL21(DE3)轉(zhuǎn)化表達(dá)，通過(guò)His-tag親和純化(Ni Sepharose6 Fast Flow)，G-25柱脫鹽，SDS-PAGE電泳檢測(cè)。 2、BALB/c小鼠多克隆抗體的制備。 1、實(shí)驗(yàn)分組情況： 1)、實(shí)驗(yàn)組：3只

3、雄性BALB/c小鼠 2)、佐劑對(duì)照組：3只雄性BALB/c小鼠 3)、生理鹽水對(duì)照組：3只雄性BALB/c小鼠 2、小鼠免疫方法： 1)、第一次免疫：將蛋白樣品與弗氏完全佐劑等體積混勻，分4點(diǎn)注射BALB/c小鼠背部皮下，總共100μl，每只小鼠約注入10μg蛋白。 2)、第二次免疫：間隔2周進(jìn)行二次免疫，使用不完全佐劑，用量同上。 3)、第二次免疫后2周進(jìn)行尾靜脈加強(qiáng)免疫，劑量為初次免

4、疫劑量的一半。 4)、加強(qiáng)免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?結(jié)果： 1、抽提豬腎總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之間)，說(shuō)明無(wú)明顯的蛋白質(zhì)和RNA污染。 2、設(shè)計(jì)引物，RT-PCR擴(kuò)增目的片段，測(cè)序證明該基因的ORF為1206bp，編碼402個(gè)氨基酸組成的酶蛋白。 3、質(zhì)粒

5、構(gòu)建、大腸桿菌E.coliBL21(DE3)表達(dá)，SDS-PAGE顯示，純化蛋白為45KD的單一條帶，與基因序列推測(cè)值一致。 4、雙向免疫擴(kuò)散(Double immunodiffusion)-抗原分析：經(jīng)過(guò)雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)分析，抗體抗原同時(shí)稀釋(Ab1：1、1：2、1：4、1：8、1：16； Ag1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64)(未出現(xiàn)抗原抗體白色沉淀線)以及抗體稀釋(Ab1：1、1：2、1：4、1

6、：8、1：16)(出現(xiàn)抗原抗體白色沉淀線)，需進(jìn)一步做ELISA定量檢測(cè)。 結(jié)論： 1、RT-PCR擴(kuò)增目的基因，瓊脂糖電泳檢測(cè)大約為1206bp，測(cè)序與gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶編碼基因(D83766)一致。 2、質(zhì)粒構(gòu)建，大腸桿菌轉(zhuǎn)化、表達(dá)，His-tag純化，SDS-PAGE檢測(cè)顯示目的蛋白分子量為45KD。 3、BALB/c小鼠抗體制備：第三次尾靜脈加強(qiáng)免疫，因?yàn)?/p>

7、小鼠尾靜脈非常細(xì)小，練習(xí)2個(gè)月后，尾靜脈注射成功率達(dá)90％以上。 4、雙向免疫擴(kuò)散(Double immunodiffusion)-抗原分析：經(jīng)過(guò)雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)分析，抗體抗原同時(shí)稀釋(Ab1：1、1：2、1：4、1：8、1：16； Ag1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64)(未出現(xiàn)抗原抗體白色沉淀線)以及抗體稀釋(Ab1：1、1：2、1：4、1：8、1：16)(出現(xiàn)抗原抗體白色沉淀線)，需進(jìn)一步做ELI