D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶的研究——細(xì)菌篩選、酶分離純化及克隆表達(dá).pdf

1、稀有糖是自然界存在極少的單糖及其衍生物的總稱，具有獨(dú)特的保健功能和潛在的醫(yī)療價(jià)值。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose3-epimerase，DTE，EC5.3.1.-)家族是稀有糖生物轉(zhuǎn)化法制備的關(guān)鍵酶。本文以探索新的DTE家族為目標(biāo)，分為菌種篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化、酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)和基因克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)4個(gè)步驟展開工作。主要結(jié)果如下：
　　 1.篩選獲得一株可產(chǎn)D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶的菌株SK011，通過形態(tài)觀

2、察、生化特性、16S rDNA序列比對，鑒定為類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides，R.sphaeroides)，定名為R.sphaeroides SK011；
　　 2.R.sphaeroides SK011液體發(fā)酵生產(chǎn)DTE的最適培養(yǎng)基和發(fā)酵條件為：碳源為葡萄糖，濃度為1％，氮源為酵母膏和胰蛋白胨，濃度分別為2％和1.25％，氯化鈉0.3％，二水磷酸二氫鈉0.3％，硫酸鎂0.05％，培養(yǎng)初始pH7.0；

3、在發(fā)酵初始添加0.2％D-塔格糖作為誘導(dǎo)物；種齡24 h，裝液量為20 mL/250 mL，接種量3％，30℃、180 rpm、避光，發(fā)酵時(shí)間36 h；
　　 3.粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose CL6B Fast Flow離子交換色譜和Superdex75凝膠過濾等步驟，分離純化得到DTE，比酶活提高26.8倍，達(dá)到13.4U/mg，經(jīng)SDS-PAGE鑒定達(dá)到電泳純，由2個(gè)相同的亞基組成，分子量為64 kD；

4、
　　 4.酶學(xué)性質(zhì)測定結(jié)果顯示，該酶最適作用溫度40℃，最適pH值9.0，在40℃以下，pH8-10之間保持穩(wěn)定；Mn2+對酶活力有促進(jìn)作用，Cu2+、Zn2+對酶活力有不同程度的抑制作用；對D-塔格糖底物專一性最強(qiáng)；該酶N-端氨基酸殘基序列依次為MKNPVGIISM，與目前已確定DTE家族均不一致，NCBI中僅檢索得到與之具有相同N-端氨基酸殘基的計(jì)算注明(Conceptual translation)序列：Rsph1702

5、93406，這是R.sphaeroides中首次發(fā)現(xiàn)的DTE家族，定名為R.sphaeroides DTE；
　　 5.成功克隆Rsph170293406基因，插入表達(dá)載體pET-22b(+)，轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)，構(gòu)建重組菌株E.coli BL21(DE3)(pET-dte)，誘導(dǎo)表達(dá)得到具有DTE的功能的重組蛋白，在pH9.0和40℃條件下表現(xiàn)最大酶活，在40℃以下，pH8-10間保持穩(wěn)定；Mn2+對酶

6、活力有促進(jìn)作用，Cu2+、Zn2+對酶活力有不同程度的抑制作用，以上酶學(xué)性質(zhì)與野生型R.sphaeroides DTE一致，說明Rsph17029_3406基因在E.coli BL21(DE3)(pET-dte)表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯后折疊成為具有活性的R.sphaeroides DTE蛋白高級結(jié)構(gòu)；確定Rsph17029_3406基因?yàn)镽.sphaeroides DTE的編碼基因，在GenBank數(shù)據(jù)庫登記，基因登記號為FJ8513