弓形蟲(chóng)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)基因的克隆、表達(dá)及生化特性研究.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)是一種呈世界范圍分布的人獸共患寄生原蟲(chóng),給人類生活和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)極大的危害,迄今免疫預(yù)防控制弓形蟲(chóng)病仍未取得突破性進(jìn)展。目前臨床可用的特效藥物較少,尋找高效、低毒的新型抗弓形蟲(chóng)藥物仍是弓形蟲(chóng)病研究的重要方向之一。類異戊二烯化合物是生物體所必需的,而2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2C-methyl-D-erythritol-4-Plaosphate,MEP)途徑是一種廣泛存在于植物、

2、細(xì)菌和多種頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)的類異戊二烯合成代謝途徑,該途徑在人和動(dòng)物體內(nèi)不存在。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(1-deoxy-D-xylulose-5-pllosphate reductoisomerase,DXR)是類異戊二烯代謝的MEP途徑中的第二個(gè)反應(yīng)酶,該酶是研制抗菌和抗原蟲(chóng)藥物的潛在靶標(biāo)。本研究根據(jù)弓形蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.toxodb.org)的T.gondii DXR基因序列,進(jìn)行克隆和原核表達(dá),分析

3、研究了其酶動(dòng)力學(xué)和抑制動(dòng)力學(xué)特征。試驗(yàn)具體分為以下幾個(gè)部分:
　　 首先根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋預(yù)測(cè)的TgDXR的ORF序列設(shè)計(jì)特異性引物,以弓形蟲(chóng)速殖子總RNA為模版,反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈,用PCR方法成功擴(kuò)增出包含整個(gè)ORF的序列片段。TgDXR的ORF全長(zhǎng)為1542 bp,編碼一個(gè)由513個(gè)氨基酸組成的多肽,理論分子量為55.7 kD。信號(hào)肽預(yù)測(cè)和多序列比對(duì)結(jié)果表明,其N-端包括由22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽和43個(gè)氨基酸組成

4、的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽,成熟的TgDXR蛋白共由448個(gè)氨基酸組成,分子量為48.6 kD。與其它物種DXR的氨基酸序列相似性在36—63％之間,三維結(jié)構(gòu)分析顯示預(yù)測(cè)的TgDXR單體蛋白中含有的α螺旋,β折疊,β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲分別為45.1％,22.9％,8.7％,和23.3％。
　　 利用DNA重組技術(shù),選擇不同的原核表達(dá)載體(pET-32a(+)、pMAL-c2x),利用E.coli Rosseta(DE3)重組表達(dá)TgDXR的不同序列

5、片段(TgDXR1:完整的ORF；TgDXR2:不包括信號(hào)肽和轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的功能片段)。結(jié)果顯示兩個(gè)重組載體都能夠得到表達(dá)；但pET-32a(+)-TgDXR重組表達(dá)蛋白以包涵體的形式存在,pMAL-c2x-TgDXR表達(dá)蛋白大部分存在于上清中。
　　 純化pMAL-c2x-TgDXR表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)及抑制動(dòng)力學(xué)分析,結(jié)果顯示,重組TgDXR(rTgDXR)能夠在二價(jià)金屬離子Mn2+的存在下,氧化NADPH并催化1-脫氧-D