e.colik12木糖異構(gòu)酶及木酮糖激酶基因的克隆及其在z.mobiliscp4中的表達(dá)

1、天津大學(xué)碩士學(xué)位論文E.coli K12木糖異構(gòu)酶及木酮糖激酶基因的克隆及其在Z.mobilis CP4中的表達(dá)姓名：郭蔚申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化工指導(dǎo)教師：劉成20060201A b s t r a c tT h e r e a l ee n e r g y a n d e n v i r o n m e n t a l a d v a n t a g e s f r o m t h e d e v e l o p m e n

2、t o fp r o d u c i n g b i o e t h a n o lf r o mt h eh y d r o l y t i cp r o d u c to f l i g n o c e l l u l o s e ．O n e o f t h e m a j o rr e s e a r c h p r o j e c t so fo u rl a b o r a t o r y i s t o c o n s t

3、 r u c t e n g i n e e r e db a c t e r i a 廿l a t c o u l df e r m e n th e x o s e ( g l u c o s e 、f r u c t o s e ) a n dp e n t o s e ( x y l o s e 、a r a b i n o s e ) s i m u l t a n e o u s l y ．T h e w o r k i n

4、t h i sp a p e r i st oe x p r e s s x y l A B g e n e i nZ ．m o b i l i s ．w h i c h i sa p a r to f o u rp r o j e c t ． W e f i r s t c l o n e d t h e s t r u c t u r eg e n e ，x y l A B ，d o w n s t r e a mo ft h ep

5、 r o m o t e r P e n ot h r o u g ht h eo v e r l a p p i n ge x t e n s i o nP C R t e c h n i q u ea n dt r a n s f o r m e di t i n t oZ m o b i l i sC P 4 ．T h e t r a n f o r m a n t sZ m o b g 括C P 4 ( p Z B 2 1 -

6、P e n o - x y l A B ) e x p r e s s e d X Ia n d X K w i t has p e d f i ca c t i v i t y v a l u eo fO ．2 3 9 U ／m g p r o t e i na n d0 ．4 1 8 U ／m gp r o t e i nr e s p e c t i v e l y ,w h i c h p r o v e d t h a tt

7、h eg e n e x y l A B c o u l db e t r a n s c r i b e da n d t r a n s l a t e du n d e r t h ec o n t r o lo f p r o m o t e r P e n oi nZ ．m o b i l i sC P 4 s t r a i n ．T h e n , w e c l o n e dt h es e q u e n c eo

8、f p r o m o t e rP g a pt o c o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tg e n e P g a p - x y l A B ，w h i c hw a s s u b s e q u e n t l y i n s e r t e d i n t o E ．c o l i - Z ．m o b i l i s s h u t t l ev e c t o r s

9、p Z A 2 2a n d p Z B 2 1 ，a n d t r a n s f o r m e d i n t o Z ．m o b i l i s C P 4 s t r a i n b ye l e c t r o p o r a t i o n ．T h e X I a n dX K 盯l z y m e s p e c i f i ca c t i v i t i e so f t r a n s f o r m a n

10、 t s Z m o b i l i sC P 4 0 Z B 2 1 一P g a p - x y l A B ) a n dZ m o b i l i sc P 4 ( p Z A 2 2 - P g a p - x y l h B ) w e r es h o w n a sf o l l o w s ：O ．4 2 0 U ／m g p r o t e i n 、O ．5 3 2 U ／m g p r o t e i na n

11、d O ．4 0 3U ／m g p r o t e i n 、O ．5 1 7U ／m g p r o t e i n ． ．T h ed a t ao f X I a n dX K e n z y m e a c t i v i t ye x p e r i m e n t sc l a r i f i e dt h a tn e i t h e rt h ec h o s e np r o m o t e r sn o r t h

12、 e s h u t t l ev e c t o f su s e dw e r e c a p a b l et om a k ea r e m a r k a b l ed i f f e r e n c e i n g e n e x y l A B e x p r e s s i o n ．T h et h i c k e n e db a n d si n t h e S D S ·P G A G Es p e c

13、 t r u m o ft h e c r u d e e w i z y m e e x t r a c t f r o m C P 4 ( p Z B 2 1 - P e n o - x y l A B ) 、C P 4( p Z B 2 1 一P g a p - x y l A B ) a n d C P 4 ( p Z A 2 2 - P g a p - x y l A B ) i n d i r e c t l y i n d

14、 i c a t e d t h ee x p r e s s i o no f x y l A a n d x y ／B ．K e yW o r d s ：Z y m o m o n a s m o b i l i s , x y l o s e i s o m e r a s e g e n e ，x y l u l o k i n a s e g e n e ，p r o m o t e r , g e n e e x p r e