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文檔簡介
1、塔格糖(D-tagatose)屬于稀有糖,是一種在自然界中存在較少的單糖,其甜味類似于蔗糖,而熱量值較低,同時還具有抗氧化、降低血糖、益生元及防齲齒的功能特性。塔格糖的生物轉(zhuǎn)化主要利用L-阿拉糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase,AI)異構(gòu)化半乳糖a本論文主要研究:篩選高產(chǎn)AI的乳酸菌;優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)AI的工藝參數(shù);乳酸菌AI的分離純化和酶學(xué)性質(zhì);AI酶活性部位的化學(xué)修飾;滲透乳酸菌細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化塔格糖的工藝條件。
2、 利用半胱氨酸.咔唑法、薄層層析法快速篩選得到產(chǎn)AI的乳酸菌Lactobacillus SK-2,根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、生化特性,結(jié)合16S rDNA,判定Lactobacillus SK-2屬于植物乳酸桿菌,命名為Lactobacillus plantarum SK-2,GenBank accession number:DQ480531。 對L.plantarum SK-2發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化及AI產(chǎn)生機(jī)理探討,結(jié)果表明,5 g/L葡萄
3、糖、玉米漿為碳源和氮源時,AI酶活最高;有機(jī)氮源效果優(yōu)于無機(jī)氮源;發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果:發(fā)酵初始pH 7.0,培養(yǎng)溫度37℃,接種量3%,培養(yǎng)時間12 h;L-5可拉伯糖是AI產(chǎn)生的最適誘導(dǎo)物。 經(jīng)過溶菌酶處理、超聲波破碎、硫酸銨沉淀、DEAE-SepharoseCL-6B Fast Flow離子交換色譜和Sepharose CL-6B凝膠過濾等步驟,純化得到LPAI(Lactobacillus plantarumSK-2 AI),
4、SDS-PAGE呈現(xiàn)單一條帶,HPLC檢測純度達(dá)96%,比酶活升高21倍,達(dá)到253 U/mg,回收率11%。由SDS-PAGE得到LPAI相對亞基分子質(zhì)量為59.6 k,而凝膠過濾色譜求得LPAI的相對分子量約為172.3k,因此,推斷LPAl分子內(nèi)有3個亞基,是一種三聚體酶。 純化的LPAI最適反應(yīng)溫度為50℃,最適反應(yīng)pH為7.0。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,在50℃條件下保溫2 h,酶活保持100%;在pH 4.5-8.5環(huán)境(50
5、℃)保存1 h后測定殘余酶活在80%以上,表明酶在pH 4.5-8.5范圍內(nèi)穩(wěn)定。 Al<'3+>,K<'+>和Na<'+>對酶活幾乎沒有影響,而Mn<'2+>,F(xiàn)e<'2+>,F(xiàn)e<'2+>,Ca<'2+>,Ba<'2+>和Ze<'2+>增強(qiáng)了酶活,Mn<'2+>增強(qiáng)酶活最大,添加20 mmol/L Mn<'2+>酶活力最高;EDTA、Cu<'2+>,Co<'2+>,Ag<'+>,pb<'2+>和Mg<'2+>則分別對酶產(chǎn)生了
6、不同程度的抑制作用,而Hg<'2+>完全抑制了酶活。 LPAI最適底物為L-阿拉伯糖,其次為D-半乳糖,另外,LPAI對海藻糖、木糖和果糖也具有催化作用;不同糖醇對LPAI均產(chǎn)生了抑制作用,木糖醇、甘露糖醇抑制作用較弱,而L-阿拉伯糖醇則完全抑制了酶活。采用Lineweaver-Burk作圖法,求得LPAI作用于D-半乳糖和L-5可拉伯糖的特征常數(shù)分別為K<,m> 119 mmol/L,V<,max>5.6μmol/min/L和
7、30 mmol/L,352.7μmol/min/L。 純酶N-端結(jié)構(gòu)前十個氨基酸殘基連接依次為:MLSVPDYEFW,發(fā)現(xiàn)與Lactobacillusplantarum、Lactobacillus pentosus來源的AI一致;進(jìn)化同源性表明乳酸菌來源的AI氨基酸序列高度保守。 LPAI在不同pH環(huán)境下紫外-可見掃描發(fā)現(xiàn),在280 nm吸收峰主要是色氨酸殘基,隨pH增加,280 nm吸收峰強(qiáng)度增加,且吸收峰波長有輕微紅
8、移,表明色氨酸基團(tuán)有可能從疏水區(qū)移動或翻轉(zhuǎn)到酶蛋白分子外部。 ApoLPAI(脫除Mn<'2+>)加入10 mM Mn<'2+>時,LPAI酶活又恢復(fù)到原來的水平。HoloLPAI(原酶)和ApoLPAI進(jìn)行差示掃描量熱分析表明,HoloLPAI熱穩(wěn)定性高于ApoLPAI,因此認(rèn)為LPAl分子中結(jié)合的Mn<'2+>對維持酶活力至關(guān)重要,而且其與酶蛋白結(jié)合形成的特殊構(gòu)象對酶的熱穩(wěn)定性也起著重要作用。 LPAI熒光分析表明,激發(fā)光波
9、長為295 nm時,最大發(fā)射熒光強(qiáng)度為335 nm。對熒光產(chǎn)生貢獻(xiàn)的色氨酸殘基可能位于一個疏水區(qū)環(huán)境中,除了在335 nm處有一發(fā)射峰外,在377nm處也有個小峰。 圓二色性分析表明,HoloLPAI脫除Mn<'2+>后,蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化,其中,β-折疊由14.8%減少為0,回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)由0變?yōu)?7.4%。隨著結(jié)構(gòu)變化,HoloLPAI中更穩(wěn)定的β-折疊減少,導(dǎo)致.ApoLPAI具有較低活性,耐熱性變差。 NB
10、S、PMSF和DEPC化學(xué)修飾造成酶活下降,說明構(gòu)成LPAI活性中心的必需氨基酸殘基有色氨酸、絲氨基酸和組氨酸。NBS滴定表明該酶含有9個色氨酸殘基,進(jìn)一步用Levy法分析化學(xué)試劑修飾后殘余酶活力與時間、修飾劑濃度的關(guān)系,計算出活性中心必需色氨酸殘基數(shù)目為2,組氨酸殘基和絲氨酸殘基均為1個。 底物保護(hù)試驗(yàn)證明:色氨酸殘基、絲氨酸殘基處在與底物結(jié)合部位。組氨酸不處在底物結(jié)合位點(diǎn),可能位于催化活性部位。 酶的熒光淬滅研究發(fā)現(xiàn)
11、,加入3 mg/ml半乳糖,酶的發(fā)射光譜峰紅移至345 nm,峰的強(qiáng)度降低,導(dǎo)致熒光淬滅。同樣加入100μmol/L NBS時,且最大吸收峰紅移至340 nm,、導(dǎo)致熒光淬滅。 酶經(jīng)NBS修飾后,α-螺旋從70.2%下降到29.8%,β-折疊則完全消失,回轉(zhuǎn)則從0增加到32.6%。NBS修飾色氨酸殘基造成酶活力下降,從二級結(jié)構(gòu)的變化可知,修飾導(dǎo)致底物結(jié)合部位的色氨酸殘基周圍環(huán)境發(fā)生明顯改變,從而造成與底物結(jié)合能力下降。
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