D-阿洛酮糖3-差向異構酶的表達及其固定化轉化D-阿洛酮糖的研究.pdf

1、D-阿洛酮糖是一種新型低熱量的功能性因子，D-果糖的差向異構體，在自然界存在極少，可以應用于食品、醫(yī)藥和保健等領域。D-阿洛酮糖3-差向異構酶(D-psicose3-epimerase，縮寫為DPE)是一種可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖進行可逆反應的胞內(nèi)異構化酶。鑒于D-阿洛酮糖多應用于食品領域，本文選用食品級微生物枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為表達宿主。本文構建了高效表達來源于Clostridiumcellulo

2、lyticumH10的DPE基因(CCDPE)以及來源于Ruminococcussp.的DPE基因(RDPE)的重組枯草芽孢桿菌工程菌株。研究了CCDPE在重組枯草芽孢桿菌中的表達與純化、酶學性質、酶的固定化以及與兩種重組酶的理化性質比較等方面的內(nèi)容。
　　來源于ClostridiumcellulolyticumH10的DPE基因片段大小約為882bp，蛋白分子量約為33kDa。用LB-Kana培養(yǎng)基（Kana含量50μg/mL）

3、在37℃、200rpm條件下培養(yǎng)重組菌株，收獲菌體后經(jīng)超聲波細胞破碎儀破碎、離心收集上清液，用Ni-NTA親和層析柱和Source15Q陰離子交換柱提純目的蛋白。SDS-PAGE結果表明，目的蛋白為可溶性表達，條帶特異性強，純化效果較為理想，純度可以達到90％以上。純化的CCDPE酶酶學性質研究表明，其最適溫度50℃、最適pH8.0，其活性不依賴金屬離子，但Co2+對其有強烈的促進作用，酶促動力學反應結果表明，該酶對D-阿洛酮糖具有較高

4、的底物特異性。
　　本文還采用了不同載體材料和固定方法對CCDPE粗酶固定化工藝影響的研究，綜合得出，以殼聚糖為載體固定CCDPE粗酶效果比較好，在對固定化工藝條件優(yōu)化后得出當固定時間為3h，[酶]∶[載體]=15∶1(U/g)時酶活回收率最高為45％。另外，本文也采用此固定化方法對枯草芽孢桿菌中表達的Ruminococcussp.的DPE粗酶進行固定化研究。對CCDPE自由酶、CCDPE固定化酶、RDPE自由酶和RDPE固定化酶

5、的最適pH、最適溫度以及金屬離子等酶學性質進行比較，結果表明，對CCDPE而言，其固定化酶的最適溫度(55℃)和pH(8.5)都高于自由酶(50℃、8.0);對RDPE而言，其固定化酶的最適溫度較自由酶相比沒有明顯改變，均為60℃，但其固定化酶的pH(9.0)高于自由酶(8.0);Ni2+、Cu2+和Zn2+均對CCDPE自由酶與固定化酶以及RDPE自由酶與固定化酶酶活性有抑制作用，Co2+和Mn2+對CCDPE自由酶酶活性有強烈的促進