維生素D-,3-的雌性性腺毒性及其機(jī)制的研究.pdf

1、本項(xiàng)目研究以維生素D3的生殖內(nèi)分泌干擾作用為核心，從維生素D3的雌激素樣活性作用和維生素D3的雌性性腺毒性、維生素D3的雌性性腺毒性機(jī)制等方面展開(kāi)研究，從而較系統(tǒng)、全面的研究維生素D3的生殖內(nèi)分泌干擾作用及其機(jī)制，為維生素D3的危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)及防治提供科學(xué)依據(jù)，為維生素D3的臨床應(yīng)用與合理補(bǔ)充提供指導(dǎo)。 一、維生素D3的子宮增重效應(yīng)及其機(jī)制 目的：通過(guò)未成年雌性小鼠的子宮營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)，探討維生素D3的子宮增重效應(yīng)及其分子機(jī)制

2、 方法：清潔級(jí)昆明種小鼠66只，21天齡，按體重隨機(jī)分為6組，每組11只，暴露劑量分別為(0.00926，0.0556，0.33，2.Omg/kg VitD3)，陽(yáng)性對(duì)照組為30μg/kg雌二醇，溶劑對(duì)照為橄欖油。每天染毒一次，連續(xù)三天。觀察小鼠子宮重量、臟器系數(shù)、子宮內(nèi)膜腔上皮厚度、固有層腺體數(shù)量及PCNA、ER表達(dá)。 結(jié)果： 1.與陰性對(duì)照組比較，雌二醇組子宮濕重及臟器系數(shù)顯著性升高(p<0.05)，維生素D3的

3、各劑量組子宮濕重較對(duì)照組無(wú)顯著性差異(p>0.05)，但是有升高的趨勢(shì)；0.0556mg/Kg、0.33mg/Kg和2.0mg/Kg VitD3劑量組的子宮臟器系數(shù)較對(duì)照組顯著性升高(p<0.05);雌二醇組子宮濕重及臟器系數(shù)顯著高于維生素D3的各劑量組(p<0.01)； 2.子宮內(nèi)膜腔上皮厚度：雌二醇組顯著高于對(duì)照組及維生素D3的各劑量組；子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量：維生素D3的各劑量組隨染毒劑量增高而增高，0.33mg/Kg和2.0

4、mg/Kg劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組均高于對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組顯著高于維生素D3的各劑量組(p<0.05或p<0.01)； 3.PCNA陽(yáng)性率：VitD3各劑量和雌二醇組均顯著高于對(duì)照組，雌二醇組高于VitD3各劑量組：ER陽(yáng)性率：對(duì)照組低于0.00926 mg/Kg、0.0556 mg/Kg、0.33 mg/Kg劑量組，高于2.0 mg/Kg劑量組；雌二醇組顯著高于對(duì)照組及0.0556 mg/Kg、0.33 mg/Kg、2.0 mg/K

5、g劑量組。 二、維生素D3的雌性性腺毒性的研究 目的：研究亞慢性暴露VitD3對(duì)雌性大鼠動(dòng)情周期、血清性激素水平及子宮、卵巢組織病理學(xué)影響，探討VitD3的雌性性腺毒性作用。 方法：健康未成年雌性Wistar大鼠，清潔級(jí)，60只，體重80±59，按體重隨機(jī)分為5組，染毒劑量分別為0、0.0167、0.1、0.6、3.6mg/kg，溶劑為橄欖油。每天腹腔注射染毒1次，連續(xù)35天。實(shí)驗(yàn)期末，待動(dòng)物進(jìn)入動(dòng)情期處死動(dòng)物。

6、觀察指標(biāo)包括體重、動(dòng)情周期、子宮濕重及臟器系數(shù)、卵巢濕重及臟器系數(shù)、各級(jí)別卵泡數(shù)目、子宮內(nèi)膜細(xì)胞的組織學(xué)觀察、血清卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)和孕酮(P4).水平。 結(jié)果： 1.染毒結(jié)束時(shí)最高劑量的體重顯著低于其它各組，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)； 2.3.6mg/kg劑量組周期時(shí)間延長(zhǎng)，其動(dòng)情間期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)； 3.3.6

7、mg/kg染毒組的子宮濕重及臟器系數(shù)顯著低于其余各組(p<0.01)，其卵巢濕重較對(duì)照組輕，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，但卵巢臟器系數(shù)與對(duì)照組比較差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 4.各劑量組閉鎖卵泡數(shù)目與對(duì)照組相比，呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，3.6mg/kg劑量組顯著高于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05) 5.3.6mg/kg劑量組血清FSH水平低于對(duì)照組(p<0.05)，各組LH水平和對(duì)照組相比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

8、義。各劑量組血清E2水平和對(duì)照組相比，呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其中3.6mg/kg劑量組血清E2顯著高于對(duì)照組(p<0.05)：各劑量組血清P4與對(duì)照組比較差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，但有下降趨勢(shì)。0 三、維生素D3的雌性性腺毒性的機(jī)制(一)(對(duì)卵巢性激素分泌及卵巢、子宮ER表達(dá)的影響) 目的：研究VitD3對(duì)卵巢分泌性激素和卵巢、子宮ER表達(dá)的影響，探討VitD3的雌性性腺毒性機(jī)制 方法： 1.采用正交

9、表L16(45)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，研究VitD3(0、10-10、10-7、10-4mol/L)和動(dòng)情周期(動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期)對(duì)卵巢切碎組織E2和P4的影響。 2.采用正交表L9(34)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，研究VitD3(0、10-7、104mol/L)和時(shí)間(4、8、24h)對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞分泌E2和P4的影響。 3.健康未成年雌性Wistar大鼠，清潔級(jí)，50只，體重80±59，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型同前。實(shí)驗(yàn)期末，待

10、動(dòng)物進(jìn)入動(dòng)情期處死動(dòng)物。觀察卵巢切碎組織體外分泌E2和P4水平、卵巢及子宮內(nèi)膜ER表達(dá)。 結(jié)果： 1.體外染VitD3可影響卵巢切碎組織體外分泌E2(p<0.01)，但不會(huì)影響分泌P4(p>0.05)，卵巢切碎組織體外分泌E2和P4與所處的動(dòng)情周期有關(guān)(p<0.01或p<0.05)； 2.不同濃度的vitD3可影響顆粒細(xì)胞分泌E2(p<0.05)，但不會(huì)影響顆粒細(xì)胞分泌P4(p>0.05)；顆粒細(xì)胞分泌E2與孵育

11、時(shí)間無(wú)關(guān)(p>0.05)，顆粒細(xì)胞分泌P4與孵育時(shí)間有關(guān)(p<0.05)。 3.3.6mg/kg VitD3體內(nèi)染毒：卵巢切碎組織P4和E2分泌明顯降低，與對(duì)照組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05) 4.3.6mg/Kg劑量組子宮內(nèi)膜下層ER表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組(p<0.05)；0.0167mg/kg、3.6mg/kg劑量組卵巢皮質(zhì)ER表達(dá)陽(yáng)性率低于對(duì)照組，而0.1mg/kg劑量組卵巢皮質(zhì)ER表達(dá)陽(yáng)性率高于對(duì)照組，

12、差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。 四、維生素D3的雌性性腺毒性的機(jī)制(二)(誘導(dǎo)大鼠卵巢細(xì)胞凋亡及其可能機(jī)制) 目的：研究VitD3對(duì)卵巢細(xì)胞凋亡的影響及其可能的機(jī)制，進(jìn)一步探討VitD3的雌性性腺毒性機(jī)制 方法： 1.完體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ屯?；采用透射電鏡觀察卵巢組織超微結(jié)構(gòu)，Tunel法檢測(cè)卵巢細(xì)胞凋亡，比色法檢測(cè)血清及卵巢組織鈣離子水平，Realtime RT-PCR法檢測(cè)ERα、ERβ、Caspa

13、se-3、Caspase-8mRNA的表達(dá)； 2.卵巢顆粒細(xì)胞(GC)培養(yǎng)同前；采用FCM測(cè)定GC凋亡 結(jié)果： 1.3.6mg/kg劑量組閉鎖卵泡及黃體顆粒細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(p<0.01)，而生長(zhǎng)卵泡、成熟卵泡各劑量組比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.對(duì)照組及各劑量組皆可見(jiàn)凋亡的細(xì)胞，與對(duì)照組組比較，3.6mg/kg劑量組異染色質(zhì)增多，成塊狀，染色質(zhì)邊集，可見(jiàn)明顯的凋亡小體，線粒體出現(xiàn)水腫，基質(zhì)變稀

14、，電子密度明顯下降，甚至空泡狀； 3.3.6mg/kg劑量組卵巢組織鈣離子濃度高于對(duì)照組(p<0.05)。 4.各染毒劑量組ERα、ERβ mRNA表達(dá)及ERα/ERβ mRNA比值與對(duì)照組比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 5.0.0167 mg/kg劑量組Caspase3mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組(p<0.05)，隨著染毒劑量增高，各染毒劑量組Caspase3、Caspase8mRNA表達(dá)有增加的趨勢(shì)，而

15、3.6 mg/kg劑量組Caspase3、Caspase8mRNA表達(dá)較對(duì)照組增高，其中，Caspase8mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組比較(p<0.01)。 6.體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，10-7和10-4mol/L的維生素D3可以增加GC的凋亡率，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率有增加的趨勢(shì)。 結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)條件下，可得出如下結(jié)論： 1.維生素D3具有子宮營(yíng)養(yǎng)作用，表現(xiàn)為子宮細(xì)胞增殖及腺體數(shù)量增多，但其作用弱于雌二醇；