工程菌生物轉(zhuǎn)化D-氨基酸及其相關(guān)酶的研究.pdf

1、D-氨基酸作為一類手性化合物，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域中的用途正在被廣泛而迅速地挖掘。但D-氨基酸難于從天然產(chǎn)物中直接獲得，雖可化學(xué)合成但路線復(fù)雜、高度污染、價(jià)格昂貴。為此利用酶生物轉(zhuǎn)化工藝，即D-海因酶(HYD)和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(CAB)兩酶催化5’-單替代海因從而獲得相應(yīng)的D-氨基酸成為首選方法，該工藝路線具有特異性好、產(chǎn)物光學(xué)純度高、無污染等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前工業(yè)生化領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。 本文將假單胞菌Pseu

2、domonas putia YZ26中的HYD基因進(jìn)行了隨機(jī)突變、定點(diǎn)突變和截短突變，并對(duì)突變后的酶性質(zhì)進(jìn)行了一系列研究。又從中華根瘤菌Sinorhizobium sp. SS-ori中克隆了CAB基因，并將其插入到表達(dá)載體中，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌宿主菌中可溶表達(dá)。同時(shí)，將這兩個(gè)酶基因分別插入到了具有不同抗性的載體中，然后把兩個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到了可以同時(shí)表達(dá)HYD和CAB的工程菌細(xì)胞。利用該工

3、程菌轉(zhuǎn)化5’-異丙基海因然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，得到了具有一定光學(xué)純度的D-纈氨酸。為生物轉(zhuǎn)化工業(yè)創(chuàng)建了工程菌一步轉(zhuǎn)化D-氨基酸的新工藝。 1．HYD的突變酶分子定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)流程包括突變體分子文庫的建立以及其高通量篩選兩個(gè)主要環(huán)節(jié)。我們?cè)谝褬?gòu)建表達(dá)工程菌株pE-hyd/E.coli BL21(DE3)的基礎(chǔ)上，利用易錯(cuò)PCR 技術(shù)使D-海因酶基因引入隨機(jī)突變，經(jīng)反復(fù)優(yōu)化，將PCR條件確立為0.15mmol/L Mn<,'2+>+3

4、mmol/L Mg<'2+>、0.3mmol/L Mn<'2+>+3mmol/L Mg<'2+>、0.5mmol/LMn<'2+>+2.5mmol/L Mg<'2+>三個(gè)離子濃度梯度。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pET-3a載體，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，利用96孔板篩選了近1，000個(gè)克隆，最終獲得較高活性的產(chǎn)酶菌株：pE-hyd<,41>/E.coli BL21(A)和pE-hyd<,45>/E.coli BL21(B)。以對(duì)

5、羥基苯海因?yàn)榈孜?，前者酶活性為初始重組菌株(pE-hyd/E.coli BL21(DE3))的2.7倍，為野生菌株P(guān)seudomonas putia YZ26的20倍；若以海因?yàn)榈孜?，則分別為1.4倍和15倍。后者以對(duì)羥基苯海因?yàn)榈孜铮瑒t分別為2.0倍和15倍。DNA序列分析表明，突變株A中海因酶基因?yàn)閮?nèi)源突變：即編碼氨基酸序列第14位的谷氨酸(Glu)的密碼子由GAA→GAG，第25位的天冬氨酸(Asp)的密碼子由GAT→GAC，兩個(gè)

6、酸性氨基酸密碼子的突變均為將生物合成過程中使用頻率高的密碼子變?yōu)槭褂妙l率低的密碼子。而突變株B中產(chǎn)生一個(gè)殘基突變，即Ala449Gly。SDS-PAGE分析表明pE-hyd<,41>/E.coliBL21(DE3)酶的表達(dá)量比初始重組菌株略有提高。將D-海因酶活性中心的239位的組氨酸殘基分別突變?yōu)镠239Y和H239L，316位的天冬氨酸殘基突變?yōu)镈316E，但突變株酶活性喪失殆盡；若將409位的組氨酸殘基變?yōu)镠409T，活力剩余40

7、％。經(jīng)(NH<,4>)<,2>SO<,4>分級(jí)沉淀、Phenyl Sepharose疏水層析純化，PAGE天然膠分析，突變酶仍然為二聚體，未發(fā)生解離現(xiàn)象；將410位的組氨酸殘基變?yōu)镠410A，活力基本喪失，僅剩余1.3％，表明相鄰二個(gè)組氨酸在酶分子構(gòu)象形成過程中所起的作用不同。 分別將 D-海因酶 N-末端和 C-末端的一個(gè)氨基酸殘基剔除后得到突變酶HYDnl(N-末端Ser缺失)和HYDcl(C-末端Arg缺失)。經(jīng)表達(dá)、純化

8、后，突變酶和完整酶(HYD)的SDS-PAGE、Native-PAGE和SEC分析表明，在完全相同的條件下，完整酶和突變酶的亞基分子量相同，但天然狀態(tài)下完整酶為二聚體，而HYDcl為單體且剩余活力為完整酶的43％，HYDnl為二聚體和單體的混合物且活力完全喪失。CD分析結(jié)果顯示，HYDcl同HYD相比沒有發(fā)生明顯改變，而HYDnl變化較大。HYD的pH穩(wěn)定性顯著增加，抗SDS能力亦有所提高，但熱穩(wěn)定性明顯降低。結(jié)果預(yù)示：D-海因酶的C-

9、末端殘基Arg顯著影響酶的分子形式及熱穩(wěn)定性，但非酶活性所必需；而其N-末端殘基Ser既是酶的結(jié)構(gòu)必需殘基，也是其活性必需殘基。 2．CAB基因的克隆及表達(dá)從菌株Sinorhizobium sp.SS-ori中純化的CAB的N-末端氨基酸序列設(shè)計(jì)了正向引物，并在已報(bào)道的不同來源菌株CAB的氨基酸序列同源性分析的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并反向引物。用該菌株總DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到一長(zhǎng)度約為0.9kb的片段，DNA測(cè)序表明其ORF為9

10、15bp。將CAB基因分別克窿到pUC18、pET3a、pET32M、pRSET、pGEX4T-2、pExSecI、pMAL—c2X等一系列表達(dá)載體中，然后在E.coli DH5 α、E.coli 2426、E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。但大多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物為包涵體而不具酶活性。最終工程菌pMD/E.coliBL21(DE3)中獲得CAB的可溶表達(dá)產(chǎn)物融合蛋白MBP-CAB(77 kDa)，SDS-PAGE光密度掃描表明，其表

11、達(dá)量約占菌體超聲后離心上清總蛋白的20％。經(jīng)Amylose親和純化和Superose 12凝膠排阻層析后達(dá)到了電泳純。根據(jù)pMAL-c2X質(zhì)粒背景，用Factor Xa剪切后，可得約42 kDa的MBP和35 kDa的CAB。酶活性檢測(cè)表明，當(dāng)用N-氨甲酰-DL-纈氨酸作為底物，以細(xì)胞濃度OD<,600nm>=10計(jì)，細(xì)胞活力為0.11U/ml·100D<,600nm>。 3.HYD和CAB的共表達(dá)雖然HYD和CAB均已在大腸桿

12、菌中實(shí)現(xiàn)了可溶表達(dá)，但鑒于質(zhì)粒的相溶性、抗性等因素，我們又將來自菌株YZ26的HYD基因插入到含有Kan抗性的pET-28a表達(dá)載體中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-hyd，將來自菌株SS-ori的CAB基因插入到含有Amp抗性的pQE30表達(dá)載體中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQE30-cab。將這兩個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入Ecoli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到一菌兩酶工程菌。對(duì)工程菌的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，利用Westem blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行

13、了鑒定。不同底物活性檢測(cè)表明，底物側(cè)鏈的疏水性對(duì)酶活性影響較大，工程菌不能轉(zhuǎn)化側(cè)鏈帶有電荷的底物。 4.D-纈氨酸的生產(chǎn)工藝?yán)蒙鲜鰳?gòu)建好的一菌兩酶工程菌對(duì)底物5’-異丙基海因轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-纈氨酸，用1 L菌體轉(zhuǎn)化400 ml 50 mmol/L底物，在37℃反應(yīng)42小時(shí)后底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)91.4％。反應(yīng)液經(jīng)離心，上清液用活性碳脫色，冷凍干燥后用乙醇漂洗等步驟得到了比旋光度為-19.4的產(chǎn)物D-纈氨酸。并進(jìn)一步利用高效液相色譜、紅外

14、、核磁對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示各種譜圖均和標(biāo)準(zhǔn)品相一致，表明其確為D-纈氨酸。 5.D-對(duì)羥基苯海因及其酶解產(chǎn)物的HPLC分析采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)分析了工程菌pE-hyd/E.coli BL21(DE3)和天然菌SS-ori轉(zhuǎn)化DL-對(duì)羥基苯海因的反應(yīng)產(chǎn)物，探討了流動(dòng)相組份及其比例對(duì)分離的影響，結(jié)果表明流動(dòng)相為50mmol/L的醋酸.醋酸鈉緩沖液(pH4.2)和甲醇的混合溶液(體積配比為90：10)為最佳洗