富鐵酵母工程菌的構(gòu)建及細胞中鐵的生物轉(zhuǎn)化、分布和結(jié)合狀態(tài)的研究.pdf

1、四川大學(xué)博士學(xué)位論文富鐵酵母工程菌的構(gòu)建及細胞中鐵的生物轉(zhuǎn)化、分布和結(jié)合狀態(tài)的研究姓名：袁玉蘭申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：劉世貴20040420四川大學(xué)博士學(xué)位論文接種量20%，控制pH34.5,30℃下發(fā)酵16h.在此條件下細胞生物量(千勤達9.3g/L，細胞鐵含量達39.8mg/g干細胞，細胞總鐵含量比搖瓶實驗結(jié)果提高了約1.4倍。3.研究分析和探討了富鐵酵母細胞將富集的無機鐵轉(zhuǎn)化成有機鐵的有機化程度、鐵在細胞中的分布情

2、況及結(jié)合狀態(tài)。酵母細胞在添加有600gg/mLFe2的培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)后吸收的鐵約為45.7%,富集的鐵中約有97.6%轉(zhuǎn)化為有機鐵，其中有相當(dāng)數(shù)量的鐵與DNA,RNA和蛋白質(zhì)發(fā)生了結(jié)合。細胞富集的鐵主要分布在細胞壁和液泡中。4.在發(fā)酵工業(yè)中，酵母菌細胞的絮凝在釀酒、乙醇等生物制品的制備過程中具有重要意義。有研究表明，絮凝性酵母具有吸附金屬離子的能力。為此構(gòu)建了以銅抗性為篩選標(biāo)記、含有絮凝基因的大腸桿菌酵母菌穿梭整合表達質(zhì)粒。將帶有多拷貝

3、絮凝基因重組質(zhì)粒和構(gòu)建的上述整合質(zhì)粒引入到富鐵酵母菌ZYF-15中。初步探討了絮凝基因?qū)毎F富集能力的影響。具體結(jié)果如下:從穿梭重組質(zhì)粒pCF-1上經(jīng)酶切獲得絮凝基因(FLOIG)片斷，此片斷與大腸桿菌一酵母菌穿梭整合載體YIPS連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得重組質(zhì)粒pIF。然后以質(zhì)粒pIF為基礎(chǔ)，將銅抗性基因表達框(CUPID-AM)插入質(zhì)粒pIF中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得了以銅抗性為篩選標(biāo)記的整合表達質(zhì)粒pIFCa將實驗室保

4、存的附加體型重組質(zhì)粒pEF-1和上述構(gòu)建的質(zhì)粒pIFC分別轉(zhuǎn)化富鐵酵母菌ZYF-15，獲得了帶有多拷貝絮凝基因的重組菌株ZYEF和整合到菌株ZYF-15染色體上URA3基因座的重組菌株ZYIFC。研究顯示，絮凝基因在菌株ZYF-15中的表達具有累加效應(yīng)，即隨基因拷貝數(shù)的增多，絮凝程度加強，對鐵的富集能力也增強。重組菌株ZYEF和ZYIFC均能明顯增強細胞對鐵的富集能力，其細胞總鐵含量分別是ZYF-15的1.5和1.3倍。富鐵酵母菌株ZY