β防御素2基因酵母工程菌的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、防御素是生物體在抵御病原微生物的防御反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一類重要的抗菌肽類物質(zhì)。它具有十分廣泛的抗菌譜，可以抵抗細(xì)菌、真菌、被膜病毒等多種微生物，尤其是哺乳動(dòng)物防御素除了對(duì)細(xì)菌、真菌、被膜病毒有毒殺作用外，還對(duì)支原體、衣原體、螺旋體及一些惡性細(xì)胞有殺傷作用。另外，防御素具有刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的作用，它可以通過趨化因子受體招募未成熟的樹突細(xì)胞與巨噬細(xì)胞到達(dá)微生物入侵的皮膚和粘膜組織，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)病源菌的特異性免疫。因此防御素在醫(yī)藥工業(yè)

2、上具有廣泛的開發(fā)和應(yīng)用前景。 目前，哺乳動(dòng)物防御素主要有α、β、θ三種。其中在畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域中，動(dòng)物β-防御素有較好的研發(fā)價(jià)值。人們已證明豬β-defensin-2具有較強(qiáng)的殺傷病源微生物的作用，并且β-defensin-2殺菌機(jī)理獨(dú)特，病源菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們希望通過生物工程手段來大量生產(chǎn)防御素。由于生物體內(nèi)天然防御素的含量很低，且提取步驟繁瑣，而化學(xué)合成法成本又很高，因此用基因工程方法大量

3、生產(chǎn)防御素?zé)o疑是最佳選擇。采用基因工程的方法合成β-defensin-2目的片段，并將其導(dǎo)入畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建β-defensin-2的酵母工程菌，以工程菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)β-defensin-2，可以很大程度的降低β-defensin-2生產(chǎn)成本，并且適合進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低且不受季節(jié)和氣候變化等外在環(huán)境的影響。此外，β-defensin-2能耐受高溫，規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)β-defensin-2時(shí)經(jīng)高溫濃縮工序

4、，可充分殺死酵母菌體而不導(dǎo)致β-defensin-2失活，產(chǎn)品在推廣后不會(huì)出現(xiàn)工程菌擴(kuò)散而導(dǎo)致環(huán)境的生態(tài)問題。 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是80年代初被開發(fā)和研制的一種新型酵母表達(dá)系統(tǒng)，近年來，它越來越受到人們的重視并被廣泛應(yīng)用。主要原因是它與傳統(tǒng)的酵母表達(dá)體系，如釀酒酵母表達(dá)體系相比，有許多優(yōu)點(diǎn):(1)畢赤酵母甲醇氧化酶(AOX)基因的強(qiáng)啟動(dòng)子特別適用于外源基因的調(diào)控表達(dá)；(2)畢赤酵母是需氧酵母菌，在有氧條件下能高密度生長(zhǎng)，因此

5、有利于擴(kuò)大生產(chǎn)獲得高濃度細(xì)胞，從而進(jìn)行高效表達(dá)；(3)畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中的蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易從培養(yǎng)基的基質(zhì)中分離；(4)通過質(zhì)粒整合到畢赤酵母基因組的外源基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易丟失；(5)外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，因此能夠篩選到高表達(dá)菌株；(6)畢赤酵母對(duì)外源蛋白產(chǎn)物進(jìn)行N-乙酰糖基化修飾后的結(jié)構(gòu)為高甘露糖型，糖鏈平均為8～14個(gè)甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含α-1，3連接的甘露糖殘基(

6、有強(qiáng)的免疫原性)，因而適用于臨床應(yīng)用；(7)使用方便、簡(jiǎn)單，而且成本較低。目前主要有三種表達(dá)宿主菌，它們的主要區(qū)別在于AOX一個(gè)基因或二個(gè)基因的缺失而造成對(duì)甲醇利用能力的改變。最常用的宿主菌是GS115(his4)，它含AOX1租AOX2基因，在含甲醇的培養(yǎng)基上以野生型速度生長(zhǎng)，它的表現(xiàn)型是Mut+。KM71(his4 arg4 aox1Δ::ARG4)宿主菌的AOX1己被S.cereavisiae的ARG4替代，因此，此宿主菌只能依賴

7、AOX2基因合成AOX，在含甲醇的培養(yǎng)基上低速度生長(zhǎng)，它的表現(xiàn)型是Muts。第三種宿主菌MC100-3(his4arg4 aox1△::SARG4 AOX2Δ::Phis4)的兩個(gè)AOX基因都被除去，不能在含甲醇的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，它的表現(xiàn)型是Muts或Mut-。上述的宿主菌的改造還可得到其他衍生的宿主菌，如SMD1163、SMD1165和SMD1168是近來開發(fā)的一類蛋白酶缺失的宿主菌，它們?yōu)楸磉_(dá)外源蛋白提供了一個(gè)減少降解的環(huán)境，有廣泛的

8、應(yīng)用價(jià)值。 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)己發(fā)表的豬β防御素2(pBD-2)氨基酸序列，參照酵母密碼子的偏愛性，設(shè)計(jì)豬β防御素2的目的基因序列，交由公司合成。將合成的目的基因片段通過SnaB I和NotI位點(diǎn)克隆至分泌型表達(dá)載體pPIC9K信號(hào)序列α因子之后的下游序列中，構(gòu)建了表達(dá)載體pPIC9K-pBD-2。用Sal I將pPIC9K-pBD-2線性化后，采用電穿孔法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)。通過調(diào)整參數(shù)，對(duì)影響電轉(zhuǎn)化效率的主要因素進(jìn)行探

9、索，建立了質(zhì)粒pPIC9K-pBD-2對(duì)畢赤酵母的高效電轉(zhuǎn)化方法。通過MD平板、MM平板、G418篩選得到Mut+表型的高拷貝轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR檢測(cè)該轉(zhuǎn)化子已正確整合入畢赤酵母染色體中。陽(yáng)性克隆經(jīng)搖瓶發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo)，發(fā)酵上清液以SDS-PAGE進(jìn)行分析，利用瓊脂孔穴擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌活性。結(jié)果表明，防御素pBD-2基因在畢赤酵母中得到表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑菌活性。 為了更好地利用基因工程技術(shù)來開發(fā)重組豬β-防御素制劑