D-對羥基苯甘氨酸生物合成酶的優(yōu)化及固定化研究.pdf

1、目的：1、對海洋沉積物進行系列性篩選，以獲得全新來源并具有潛在高性能的海因酶，并提供一種全新的海因酶陽性菌篩選體系和一種全新的酶優(yōu)化手段。2、構建快速篩選模型，篩選性能更優(yōu)的海因酶突變體，并為同類酶的優(yōu)化提供依據(jù)。3、對海因酶工程菌進行固定化研究，獲得全細胞固定海因酶產(chǎn)生菌的最優(yōu)配方，為D-對羥基苯甘氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。
　　方法：1、以實驗室保存的鏈霉菌庫為篩選對象，利用唯一氮源法、雙層瓊脂法、微孔快速篩選法和分子生物學篩

2、選法對其進行系列性篩選，獲得可表達海因酶的陽性鏈霉菌；從篩選獲得陽性菌中擴增目的片段，分析基因序列并進行工程菌構建；測定海因酶的酶活和動力學參數(shù)；利用Swiss-model在線軟件對海因酶進行在線同源建模和Caver Analyst軟件對其的催化通道進行結構模擬分析；2、利用易錯PCR構建海因酶突變庫；構建快速篩選模型進行突變酶篩選；對突變酶的酶學性質進行測定；3、利用海藻酸鈉作為固定載體，對海因酶工程菌進行全細胞固定化研究；優(yōu)化海藻酸

3、鈉濃度、硅藻土濃度、戊二醛濃度、CaCl2濃度和MnCl2濃度；測定固定化小球的最適直徑和最適添加濃度；測定固定化全細胞小球的批次實驗次數(shù)；測定固定化全細胞小球的機械強度。
　　結果：1、篩選獲得四株陽性菌，分別命名為S1、S14、S29和S145菌株，隨后對不同菌株來源的海因酶的酶動力學參數(shù)進行測定，結果顯示，S145菌株來源的海因酶活性最高，為9.7 U/mg，催化動力學常數(shù) Kcat=3.2×10-6/s，Km=9.5 mm

4、ol/L；海因酶結構的同源模建和催化通道模擬分析，結果顯示其主要催化通道Tunnel_1長度為9.1?，瓶頸氨基酸殘基為50位的組氨酸、181位的組氨酸和313位的谷氨酸，瓶頸半徑為2.18?；潛在催化通道Tunnel_2長度為13.6?，瓶頸氨基酸為62位的蘇氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸，瓶頸半徑為1.52?；2、篩選出七株陽性突變菌，突變位點主要集中在181位和286位；181位突變菌的酶活為11.5 U/mg，對產(chǎn)物的

5、耐受力提高10％；286位突變菌的酶活為11.0 U/mg，對底物的耐受力提高11%；3獲得固定化細胞的最優(yōu)配方為：3.0%海藻酸鈉、1.5%硅藻土、0.05%CaCl2和1.0 mM MnCl2；固定化小球最適直徑位2.6 mm，所占濃度最適為20%；固定化全細胞小球可重復使用12批次，其催化生產(chǎn)產(chǎn)物的產(chǎn)率為88%以上。
　　結論：1、開發(fā)了一種海因酶系列篩選策略，獲得潛在的酶優(yōu)化位點，為后期酶的優(yōu)化提供理論基礎；2、篩選獲得了