β-淀粉酶-海藻糖合酶雙功能融合酶表達、分離純化及酶學特性的研究.pdf

1、海藻糖，新型非還原性二糖，具有優(yōu)良的保護特性。可在高熱環(huán)境下保護食品、化妝品和藥物，穩(wěn)定其中含有的蛋白的結構不變性，因此，使得海藻糖的商品化前景潛力巨大。
　　海藻糖的生產(chǎn)工藝復雜，導致生產(chǎn)成本過高，阻礙了海藻糖的應用。本研究以融合了β-淀粉酶基因和海藻糖合酶基因的雙功能融合酶蛋白為基礎，通過分離純化手段去除雜蛋白，分析融合酶的酶學特性，通過優(yōu)化剛性連接肽長度獲得比較穩(wěn)定、高效的雙功能融合酶。
　　本研究首先在M9培養(yǎng)基的基

2、礎上，采用單因素結合正交法優(yōu)化培養(yǎng)基，并命名為M9-MZ，并對誘導表達條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后融合酶BT3在pH7.0、45℃下以6％的直鏈淀粉為底物催化反應6 h后，海藻糖的濃度最高為18.52 g/L，海藻糖轉化率為30.87%，粗酶液的酶活力為13.6 U/mL。與M9-ZJ-LM培養(yǎng)基得到的結果相比，融合酶酶活力提高了28.5%。
　　本研究根據(jù)融合酶的6×His-tag標簽，首先采用Ni-NTA親和層析進一步結合陰離子交換

3、層析得到純融合酶，最終的純化倍數(shù)為12.97，酶活力回收率為25.37%。經(jīng)過測定酶學性質：最適反應溫度為40℃；最適pH8.0，向堿性方向偏移了0.5個單位；熱穩(wěn)定性比單酶高，耐堿能力也高于單酶；3 mmol/L金屬離子Ba2+、Co2+、Cu2+存在下三種酶的活力明顯受到抑制，Mg2+對酶活力有促進作用。經(jīng)過 HPLC測定，融合酶BT3的酶活力為92.4 U。催化6%直鏈淀粉溶液，純化后的融合酶BT3轉化海藻糖濃度為33.72g/L

4、，產(chǎn)率為56.2%，比純化前(18.52g/L，30.9%)提高了26.7%，融合酶BT3的海藻糖產(chǎn)率與混合酶系相比提高了6%。
　　本研究通過替換不同長度的剛性連接肽(EAAAK)n，n=2-4，重新得到了三種融合酶BT3-A，BT3-B，BT3-C。通過比較純化后三種融合酶催化6%直鏈淀粉溶液，海藻糖濃度分別為：30.36 g/L、32.29 g/L和37.99 g/L。其中，BT3-C催化得到的海藻糖濃度高，海藻糖產(chǎn)率達到6