葡萄糖醛酸寡糖和N-乙酰己糖胺寡糖酶法合成的研究.pdf

1、自然界中存在大量的寡糖類化合物,不同的寡糖種類和來源決定了它們特有的生物學活性。以糖醛酸和N-乙酰己糖胺為主要組成單位的糖胺聚糖(GAGs)具有細胞識別、抗凝血、抑制血管平滑肌細胞增生、抗炎、抗腫瘤等重要的生物學功能,因此成為糖生物學研究的熱點。利用β-葡萄糖醛酸酶以及β-D-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基活性可以合成與糖胺聚糖中的寡糖鏈結構相似的醛酸寡糖及N-乙酰胺基寡糖,它們的合成對于進一步研究糖胺聚糖的生物學活性與結構具有重要的意義。本文對利

2、用來源于牛肝的β-葡萄糖醛酸酶和來源于B.circulans的β-D-半乳糖苷酶合成寡糖、各種寡糖產(chǎn)物的分離、純化和結構鑒定以及酶法合成的條件優(yōu)化進行了系統(tǒng)地研究。
　　 第一、使用來源于牛肝的β-葡萄糖醛酸酶作為催化劑,以pNP-β-D-葡萄糖醛酸(pNP-β—D-GlcA)為供體,分別以pNP-β-D-葡萄糖醛酸苷、pNP-α-D-葡萄糖苷(pNP-α-D-Glc)以及pNP-α-D半乳糖苷(pNP-α-D-Gal)作為受體

3、,進行酶法合成。經(jīng)HPLC法檢測轉(zhuǎn)糖基反應產(chǎn)物,結果表明,牛肝β-葡萄糖醛酸酶能有效的催化葡萄糖醛酸二糖的合成。然后通過(A)KTA層析儀與Zorbax SB-C18半制備柱的配合使用對酶法合成的葡萄糖醛酸寡糖產(chǎn)物進行了分離純化,獲得4種寡糖純品。最后利用ESI-TOF-MS、1H-NMR、13C-NMR等分析手段對產(chǎn)物純品進行結構鑒定。發(fā)現(xiàn)來源于牛肝的β-葡萄糖醛酸酶催化轉(zhuǎn)糖基反應時,以pNP-β-D-葡萄糖醛酸為底物的自縮合反應產(chǎn)物

4、和以pNP-α-D-葡萄糖苷為受體的酶反應產(chǎn)物主要以β-(1→3)糖苷鍵的形式存在,產(chǎn)物結構式分別為:p-NPβ-D-GlcA-(1→3)-β-D-GlcA和p-NPα-D-GlcA-(1→3)-β-D-Glc；而以pNP-α-D-半乳糖苷為受體的轉(zhuǎn)糖基反應中同時存在β-(1→2)和β-(1→4)兩種形式的產(chǎn)物,結構式分別為:p-NPα-D-GlcA-(1→2)-β-D-Gal和p-NPα-D-GlcA-(1→4)-β-D-Gal。

5、r>　　 第二、對牛肝β-葡萄糖醛酸酶酶轉(zhuǎn)糖基反應的反應溫度、pH、底物濃度、供受和酶濃度等條件進行研究,確定了合成各種葡萄糖醛酸寡糖的最佳條件。結果表明,反應溫度、pH、底物濃度以及供受體比為反應的主要影響因素,而酶濃度次要影響因素。各物質(zhì)合成的最優(yōu)條件為:(1)p-NPα-D-GlcA-(1→3)-β-D-Glc(產(chǎn)物2):13％的pNP-β-D-GlcA和pNP-α-D-Glc作為底物,pH=6.0,反應溫度為35℃,pNP-β

6、-D-GlcA和pNP-α-D-Glc的摩爾比率為3:1,酶濃度為13 U/μL,此時產(chǎn)物產(chǎn)率為28.8％。(2)p-NPα-D—GlcA-(1→2)-β-D-Gal(產(chǎn)物3)以及p-NPα—D—GlcA-(1→4)-β-D-Gal(產(chǎn)物4):15％的pNP-β-D-GlcA和pNP-α-D-Gal作為底物,pH=6.0,反應溫度為35℃,pNP-β-D-GlcA和pNP-α-D-Gal的摩爾比率為2:1,酶濃度為12 U/μL,此時產(chǎn)

7、物3和4的產(chǎn)率分別為35.4％和31.7％。
　　 第三、使用來源于B.circulans中的β-D-半乳糖苷酶作為催化劑,以乳糖為供體,分別以pNP-β-D-氮乙酰葡萄糖胺(pNP-β-D-GlcNAc)、pNP-β-D氮乙酰半乳糖胺(pNP-β—D-GalNAc)作為受體,進行酶法合成。經(jīng)HPLC法檢測轉(zhuǎn)糖基反應產(chǎn)物,結果表明,來源于B.circulans的β-D-半乳糖苷酶能有效的催化N-乙酰己糖胺寡糖的合成。通過中壓層析

8、與Toyopearl HW-40S柱的配合使用對酶法合成的產(chǎn)物進行分離純化,獲得7種N-乙酰己糖胺寡糖純品,各物質(zhì)通過ESI-TOF-MS、1H-NMR、13C-NMR等分析手段進行結構分析,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物主要以β-(1→4)糖苷鍵的形式存在,還有少量以β-(1→6)糖苷鍵的形式存在,產(chǎn)物的聚合度為2至4。以乳糖為供體,pNP-β-D-GlcNAc為受體的酶反應得到了產(chǎn)物5、6、7和8,其結構式分別為:p-NPβ-D-Gal-(1→4)-β-

9、D-GlcNAc,p-Npβ-D-Gal-(1→6)-β-D-GlcNAc,p-NPβ-D-Gal-(1→4)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc以及p-NPβ-D-Gal-(1→4)-β—D-Gal-(1→4)-β-D-Gal-(1→4)-β-D-GlcNAc；以乳糖為供體,pNP-β-D-GalNAc為受體的酶反應得到了三種產(chǎn)物9、10和11,結構式分別為:p-NPβ-D-Gal-(1→4)-β-D-GalNAc,p-