單葡萄糖醛酸甘草次酸分離純化的研究.pdf

1、甘草是我國(guó)一種傳統(tǒng)的中草藥，其主要成份甘草酸（glycyrrhizin 或glycyrrhizic acid, GL）具有抗炎癥，抗病毒，抗腫瘤，抗過(guò)敏等作用，而且它是一種甜味劑，甜度約是蔗糖的170 倍。單葡萄糖醛酸甘草次酸（glycyrrhetic acid3-O-mono-β-D-glucuronide, GAMG）作為GL 的衍生物，兩者具有相似的生物活性，其在抗炎和抗過(guò)敏活性上等同或超過(guò)GL，而且具有顯著的抗癌作用。GAMG是

2、一種新型的天然甜味劑，甜度約是GL 的5 倍。因此，GAMG 具有重要的研究?jī)r(jià)值。近年來(lái)，生物轉(zhuǎn)化GL 而直接制備GAMG 成為研究熱點(diǎn)。本論文圍繞GAMG 的酶法制備工藝及GAMG 的分離純化工藝展開(kāi)系統(tǒng)的研究。主要工作總結(jié)如下： 1）建立了一種能同時(shí)檢測(cè)生物轉(zhuǎn)化體系中GL 和GAMG 的常規(guī)等度洗脫反相高效液相色譜的定量分析方法。采用Apollo C18 分析柱，流動(dòng)相是V(甲醇)：V(水)：V(冰醋酸)＝75：25：5，

3、流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫為室溫。在進(jìn)樣量0.2～20 μg 內(nèi)成良好的線(xiàn)性關(guān)系，GL 的加樣回收率為97.47％~99.32％ ， RSD 為0.88％~3.78％ ； GAMG 加樣回收率為92.68％~98.44％，RSD 為1.07％~3.95％。該法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)捷、耗材低廉。 2）GAMG 制備工藝的研究。方法一：利用固態(tài)的酶顆粒對(duì)GL 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后蒸干溶劑，得粗品GAMG

4、；方法二：使用游離狀態(tài)的酶及膜固定化反應(yīng)裝置對(duì)GL 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化而制得GAMG 的粗品溶液，經(jīng)噴霧干燥后得其粗品。 3）系統(tǒng)地研究了樹(shù)脂對(duì)GL 及GAMG 的吸附分離，主要包括以下內(nèi)容： (1) 樹(shù)脂的初步篩選。通過(guò)研究九種樹(shù)脂對(duì)GL 及GAMG 的靜態(tài)吸附，篩選出HP-20，NKA，X-5 這三種非極性大孔吸附樹(shù)脂及D380 弱堿性陰離子交換樹(shù)脂。 (2) 溶液的pH 值對(duì)樹(shù)脂吸附的影響。溶液的pH 值會(huì)

5、影響樹(shù)脂的吸附容量，確定在進(jìn)行吸附時(shí)溶液的pH 值為5。 (3) 等溫吸附行為的研究。將HP-20，NKA，X-5，D380 這四種樹(shù)脂對(duì)GL 及GAMG的吸附等溫線(xiàn)用Freundlich 方程進(jìn)行擬合，其中X-5 樹(shù)脂對(duì)GAMG 吸附擬合得到的方程的相關(guān)性最好；D380 樹(shù)脂對(duì)GL 及GAMG 均有較大的吸附容量；D380樹(shù)脂對(duì)GL 及GAMG 吸附時(shí)的作用力最強(qiáng)，而NKA 樹(shù)脂對(duì)它們的吸附作用力最弱。比較HP-20，NKA

6、，X-5，D380 這四種樹(shù)脂對(duì)GL 溶液及GAMG 溶液中的GL 的吸附等溫線(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在吸附時(shí)溶液中GAMG 的存在會(huì)與GL 產(chǎn)生一定的競(jìng)爭(zhēng)性吸附作用。 (4) 靜態(tài)洗脫行為的研究。用不同濃度的乙醇-水溶液作為洗脫液對(duì)上述吸附過(guò)溶液的四種樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)的洗脫，它們對(duì)吸附在HP-20，NKA，X-5 樹(shù)脂上的GL及GAMG 沒(méi)有一定的選擇性，而且不能將D380 樹(shù)脂上吸附的物質(zhì)洗脫下來(lái)。使用不同濃度的NaOH、氨水溶液作為洗脫液，

7、或者向其中加入不同濃度的NaCl溶液或乙醇溶液作為D380 樹(shù)脂的洗脫液，實(shí)驗(yàn)表明其洗脫效果不理想，且沒(méi)有一定的選擇性。綜合考慮，選擇HP-20，NKA，X-5 這三種非極性大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究。 (5) 吸附動(dòng)力學(xué)行為的研究。NKA 樹(shù)脂對(duì)GL 的吸附速度較NKA，X-5 樹(shù)脂要慢，在未達(dá)到飽和吸附前該樹(shù)脂的吸附量相對(duì)較少，而這三種樹(shù)脂對(duì)GAMG 的吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)無(wú)明顯差別，同時(shí)考慮到經(jīng)濟(jì)因素及NKA 樹(shù)脂的

8、吸附交換系數(shù)明顯大于其它兩種樹(shù)脂，選擇NKA 樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)。 (6) 動(dòng)態(tài)吸附及洗脫行為的研究。對(duì)NKA 樹(shù)脂裝填的交換柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，繪制出貫穿曲線(xiàn)；用不同濃度的乙醇-水溶液對(duì)吸附過(guò)溶液的NKA 樹(shù)脂裝填的交換柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)的梯度洗脫，在乙醇-水溶液的濃度大于70％時(shí)，可以收集得到純度為85.02％的GAMG，收率是35.36％。 4）采用加壓型制備色譜對(duì)樹(shù)脂分離純化得到的GAMG 進(jìn)行進(jìn)一步的純化。質(zhì)譜及核磁