產(chǎn)耐熱α-葡萄糖苷酶重組大腸桿菌的構(gòu)建及發(fā)酵條件優(yōu)化研究.pdf

1、α-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界生物體內(nèi)，種類繁多，性質(zhì)各異。它是一種限制性水解酶，可從低聚糖類底物的非還原末端切開α-1,4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一糖類底物形成α-1，6糖苷鍵，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖或糖脂、糖肽等。
　　 Α-葡萄糖苷酶應(yīng)用于生產(chǎn)低聚異麥芽糖，受到食品工業(yè)界的重視。但生產(chǎn)過程中的環(huán)境條件對(duì)酶活影響很大，因此耐熱α-葡萄糖苷酶成為研究的熱點(diǎn)之一。
　　 本實(shí)驗(yàn)以非解朊

2、棲熱菌HG102 α-葡萄糖苷酶基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增α-葡萄糖苷酶基因，與表達(dá)載體pET28α(+)連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選陽性重組體，酶切檢驗(yàn)，然后把構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎，蛋白加熱沉淀和SDS-PAGE電泳分析。
　　 結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增得到1 900 bp左右的DNA片段，重組基因誘導(dǎo)表達(dá)后檢測(cè)得α-葡萄糖苷酶酶活，

3、蛋白經(jīng)電泳分析顯示其相對(duì)分子質(zhì)量約為65 KD，與理論值相符。經(jīng)測(cè)序，克隆的基因序列與文獻(xiàn)一致。
　　 對(duì)取得的α-葡萄糖苷酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，α-葡萄糖苷酶的最適pH為7.0，且在pH5.0-8.0條件下具有較好的穩(wěn)定性。Α-葡萄糖苷酶的最適溫度為85 ℃，在85 ℃條件下熱處理3 h后，α-葡萄糖苷酶的活性約為初始值的60％，具有較好的熱穩(wěn)定性。
　　 對(duì)重組菌進(jìn)行了碳源、接種量、金屬離子、IPTG添加時(shí)間、

4、誘導(dǎo)時(shí)間單因素培養(yǎng)條件優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果：在LB液體培養(yǎng)基中添加1％甘油和0.01％的Mn2＋，接種量為6％，發(fā)酵培養(yǎng)2 h時(shí)，添加IPTG至終濃度為 1.2 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)16 h，得到的α-葡萄糖苷酶酶活最高，最終酶活由初始的4.25 U/mL 提高到40.85 U/mL，提高了8.6倍。
　　 根據(jù)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以α-葡萄糖苷酶酶活為指標(biāo)，選取接種量、誘導(dǎo)劑添加時(shí)間及誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為考察因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交