綠色木霉耐熱β-葡萄糖苷酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征.pdf

1、β-葡萄糖苷酶是纖維素水解的關(guān)鍵酶之一，但是目前纖維素酶生產(chǎn)菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶普遍含量少、活性低，嚴(yán)重制約纖維素酶解技術(shù)的發(fā)展。本研究以綠色木霉GIM3.139為試驗(yàn)對象，首先優(yōu)化其發(fā)酵條件，在最佳發(fā)酵條件下，分離純化得到電泳純的β-葡萄糖苷酶，進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究和結(jié)構(gòu)鑒定，并對其基因進(jìn)行體外擴(kuò)增、序列和活性位點(diǎn)分析，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.通過單因素正交試驗(yàn)和響應(yīng)面方法優(yōu)化其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件

2、。確定最佳培養(yǎng)基成分為:乳糖3％，氯化銨0.1％，MgSO4·7H2O0.1％;最佳發(fā)酵條件為:接種量為5％，轉(zhuǎn)速160 r/min，裝液量100mL。在此最佳條件下，β-葡萄糖苷酶酶活力為1.953U/mL，較初始酶活提高了144％。
　　2.選用AKTA Purifier100全自動(dòng)層析儀Sephadex G-200凝膠柱對β-葡萄糖苷酶粗酶液進(jìn)行分離純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測達(dá)到電泳純，并研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)

3、，該酶最適反應(yīng)溫度為80℃，最適pH值為6.16，耐酸堿穩(wěn)定性好。金屬離子中，F(xiàn)e3+、Mg2+、K+對β-葡萄糖苷酶的活性起抑制作用，其中Fe3+對該酶的抑制作用最為明顯，F(xiàn)e2+、Mn2+對β-葡萄糖苷酶的活性起激活作用，其中Mn2+對β-葡萄糖苷酶的激活作用最為明顯。有機(jī)溶劑中，甲醇、丙酮對該酶起到激活作用，其中甲醇的激活作用最明顯，而乙酸乙酯對該酶具有明顯的抑制作用。
　　3.提取綠色木霉GIM3.139的基因組DNA，以

4、其為模板利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到大小為2278 bp的bgl基因，并進(jìn)行序列分析:該基因編碼的β-葡萄糖苷酶分子量約為78.2143 kDa，含744個(gè)氨基酸殘基，最可能的剪切位點(diǎn)預(yù)測在第19位點(diǎn)和第20位點(diǎn)，且為分泌型蛋白;親疏水性氨基酸分布均勻;該蛋白是以α螺旋5次跨膜;其二級結(jié)構(gòu)為:無規(guī)則卷曲60.08％，β-折疊17.07％，α-螺旋22.85％;利用在線軟件PDBsumGenerate和Swiss-Model Workspace