木糖苷酶的酶學性質分析及定向進化.pdf

1、半纖維素是自然界中第二大可再生資源，人們對其組分最豐富的木聚糖的降解研究及其生物轉化技術探索方興未艾。在木聚糖降解酶系中內切木聚糖酶和β-木糖苷酶都是非常重要的糖苷水解酶。β-木糖苷酶已經應用于傳統(tǒng)工業(yè)工藝中。在養(yǎng)殖業(yè)，β-木糖苷酶可以改善飼料的營養(yǎng)價值提高肉類的品質。在食品工業(yè)，木糖苷酶一般用作浸漬酶，主要應用于萃取和澄清果汁，提高品質。在釀造工業(yè)，β-木糖苷酶可以降低啤酒和葡萄汁的粘稠度和渾濁度，提高過濾后的澄清度，提高酒的穩(wěn)定性和

2、香醇性。在造紙工業(yè)，β-木糖苷酶可以減少化學品的消耗。木糖苷酶與其它半纖維素酶一起具有很多潛在的應用包括咖啡工藝，蔬菜浸漬，高纖維烘焙材料與顏料的制備，調味品，淀粉抽提，清潔劑工業(yè)以及抗菌和抗氧化的多糖活性藥物等。
　　 本文分別從深海嗜熱細菌嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)和真菌煙曲霉(Aspergillus fumigatus)中克隆了β-木糖苷酶(β-xylosidase)基

3、因，并在大腸桿菌DE3中表達、純化和研究其酶學性質。研究結果如下。
　　 1.來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的β-木糖苷酶(gsxyn)基因全長2118 bp，起始密碼子為ATG，終止子為TAA，GC含量為51.37％。gsxyn編碼705個氨基酸，等電點pI為5.03，分子量為79.82 kDa。通過SignalP4.1 Server預測氨基酸序列沒有信號肽。通過BLAST比對，GSxyn屬于第52家族糖苷水解酶，催化氨基酸殘基為Glu

4、-335和Asp-495。將gsxyn基因克隆到表達載體pGEX-6p-1上，在大腸桿菌DE3中表達，然后純化和分析木糖苷酶的酶學性質。GSxyn在pH5.5和70℃時酶活最高;在以對硝基苯-β-D-吡喃木糖苷(ρNPX)作為底物時，GSxyn的Km為0.48 mM，Vmax為27.54μmol/mg·min，kcat為36.63 s-1和kcat/Km為76.99 L/s·mmol。
　　 為了探索木糖苷酶的底物特異性，研究多

5、功能酶結構特點，通過木糖苷酶的定點突變(Y509E)引入了木聚糖酶的活性，并保持有原始的木糖苷酶活性。通過高效液相陰離子交換色譜層析(HPAEC)測定引入的木聚糖酶是水解酶。在這過程中分別研究了在突變之后木糖苷酶和木聚糖的酶學性質。突變體Y509E的木糖苷酶(Y509Exyn)活性:Y509Exyn在pH5.5和60℃時酶活最高;在以對硝基苯-β-D-吡喃木糖苷(ρNPX)作為底物時，Y509Exyn的Km為0.51 mM，Vmax為1

6、5.52μmol/mg·min，kcat為20.64 s-1和kcat/Km為40.75 L/s·mmol。突變體Y509E的木聚糖酶(Y509Exyl)活性:Y509Exyl在pH6.5和50℃時酶活最高;在以山毛櫸木聚糖作為底物時，Y509Exyl的Km為5.10 mg/mL，Vmax為16.94μmol/mg·min，kcat為22.53s-1和kcat/Km為4.42 mL/s·mg。因此，這部分實驗結果證明第52家族木糖苷酶可

7、以為一般構建具有多催化功能的酶，特別是能夠降解工業(yè)上重要的復雜的物質（如植物細胞壁）的糖苷水解酶，提供一個研究的平臺。
　　 2.來自煙曲霉的β-木糖苷酶(afc6xyn)基因全長1595 bp，在第六染色體上，包含有一個內含子。afc6xyn基因的ORF為1542 bp，起始密碼子為ATG，終止子為TAA，GC含量為51.62％。afc6xyn編碼513個氨基酸，等電點pI為5.60，分子量為57.36 kDa。通過Signa

8、lP4.1 Server預測氨基酸序列沒有信號肽。通過BLAST比對，Afc6xyn屬于第43家族糖苷水解酶，催化氨基酸殘基為Asp-140和Glu-194。將afc6xyn基因克隆到表達載體pGEX-6p-1上，在大腸桿菌DE3中表達，然后純化和分析木糖苷酶酶學性質。Afc6xyn在pH6.0和50℃時酶活最高;在以對硝基苯-β-D-吡喃木糖苷(ρNPX)作為底物時，Afc6xyn的Km為0.56 mM，Vmax為0.25μmol/m