轉(zhuǎn)座酶Tn3體外定向進(jìn)化.pdf

1、論文答辯日期碩士學(xué)位論文密級(jí)公玨編號(hào)——Tn3體外定向進(jìn)化李曉劍研究方向塞查籃剖皇組織胚臉堂指導(dǎo)教師鍪塞強(qiáng)亙生塾拯2011—5—30答辯委員會(huì)主席魚匿隆撾教援論文評(píng)閱人魚臣隆撾塑援迕典逝研究員轉(zhuǎn)座酶Tn3體外定向進(jìn)化摘要Tn3是存在于生物體內(nèi)的一種非常重要的轉(zhuǎn)座酶，為了提高轉(zhuǎn)座酶Tn3的酶活力，本實(shí)驗(yàn)以重組EcoliDH5a／pBAD33Tn3為親本，采用易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)與DNA重排相結(jié)合的方法對(duì)轉(zhuǎn)座酶Tn3進(jìn)行體外定向

2、進(jìn)化研究。主要研究結(jié)果如下：①為了對(duì)Tn3進(jìn)行克隆，首先要進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)引物設(shè)計(jì)軟件Primer50最終確定其上游引物PI：5’CGATCGCTTAAGCTCGAGTCCACC3’下游引物PII：5’TCGW—rACCTCGACl]隊(duì)C1m盯CCTC3’。②為了確定PCR擴(kuò)增最優(yōu)反應(yīng)體系，將單因素法與均勻設(shè)計(jì)相結(jié)合，分別對(duì)多個(gè)影響因素進(jìn)行考察，最終的PCR反應(yīng)體系為：DNA模板30ng、引物P1／P211I_tmolL～、eachdN

3、TP175I_tLmolL～、10X緩沖液lpL、MgCl2251amolL。和taqDNA聚合酶1U。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5“C120sec／95。C20see，64。C30sec，72C50sec／72。C10minx32個(gè)循環(huán)。③為了確定易錯(cuò)PCR擴(kuò)增最優(yōu)反應(yīng)體系，運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行考察，最終確定的反應(yīng)體系為：MnCl205mmolL—MgCl27mmolL‘1lOx緩沖液1pLdATP／dGTP02mmolLJdT