TEM型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的體外定向進化研究.pdf

1、目的： 應用DNA家族改組方法提高TEM型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的活性，預測三級結構來探討TEM型ESBLs結構與活性的關系，為新型β-內(nèi)酰胺類抗菌素清除劑的研制打下基礎。 方法： 1.blaTEM突變文庫的構建、篩選和序列測定經(jīng)DNA家族改組獲得與原基因大小相同的改組后基因，將其克隆入原核表達質(zhì)粒pET28a(+)，構建突變文庫。利用酶的催化特點建立了基于平皿初篩和瓊脂稀釋法復篩的篩選體系，該篩選系統(tǒng)以最低抑

2、菌濃度為指標。對活性增高菌株blaTEM基因進行序列測定，并預測分析其蛋白質(zhì)三級結構。 2.重組質(zhì)粒pET28a-blaTEM-3和pET28a-blaTEMm-2在大腸桿菌中誘導表達及其優(yōu)化將重組質(zhì)粒pET28a-blaTEM-3和pET28a-blaTEMm-2(從突變株MutE-11獲得)轉化入EcoliBL21(DE3)，IPTG誘導表達，SDS-PAGE分析。在不同條件下(誘導溫度、誘導時間和IPTG濃度)誘導表達后

3、比較不同條件下重組蛋白表達情況，以選擇最佳的誘導條件。 3.重組TEM-3型ESBL和FEMm-2ESBL包涵體的復性和純化及其酶動力學分析大量表達分離重組TEM-3型ESBL和TEMm-2ESBL包涵體，并用2mol/L，尿素和1％TritonX-100反復洗滌。以8mol/L尿素溶解包涵體，將包涵體裂解液上樣于弱陰離子交換柱DEAESepharoseFF，進行柱上復性，復性產(chǎn)物進一步用分子篩SephadexG-75純化。復

4、性純化產(chǎn)物進行酶動力學分析，比較改組前后酶動力學變化情況。 結果： 1.突變文庫的篩選及突變株的序列分析經(jīng)過一輪DNA家族改組成功構建突變文庫，并篩選獲得兩株耐藥性增加的突變株MutE-7和MutE-11，MutE-7菌株耐藥性增高不明顯，除CAZ對其MIC較對改組前的菌株有4-8倍增加外，其他抗生素對其MIC沒有變化，其核苷酸序列有7個堿基替換，氨基酸改變?yōu)镋104K，R164S：而對于MutE-11菌株，耐藥性增

5、高表現(xiàn)為MIC值增高2-4倍(AMP)、4-8倍(CEZ)、4-8倍(CXM)、16-32倍(CAZ)、8倍以上(CRO)和4-8倍(CTX)，其核苷酸序列有7個堿基替換，氨基酸改變?yōu)镾59G，R164S，A237T和E240K。 2.重組質(zhì)粒在原核系統(tǒng)中的誘導表達及優(yōu)化重組菌pET28a(+)-blaTEM-3/BL21(DE3)和pET28a(+)-blaTEMm-2/BL21(DE3)在EcoliBL21(DE3)中上清

6、表達較少，主要以包涵體形式表達，通過優(yōu)化誘導條件顯示IPTG濃度為0.1mmol/L、誘導溫度為30℃、誘導時間4h以上能高效表達TEMm-2ESBL。 3.TEM-3型ESBL和TEMm-2ESBL包涵體的復性和純化及酶動力學分析變性的重組TEM-3型ESBL和TEMm-2ESBL包涵體經(jīng)陰離子交換層析柱DEAESF.F.柱上復性、純化和分子篩SephadexG-75進一步純化后純度達90％。改組前后TEM型ESBL酶動力學

7、分析結果顯示，經(jīng)DNA家族改組TEMm-2ESBL對β-內(nèi)酰胺類抗生素的催化效率有不同程度的改變，與改組前TEM-3型ESBL相比對青霉素G和氨芐青霉素的Kcat/Km分別增高1.5倍和4.4倍，對頭孢唑啉和頭孢他啶的Kcat/Km分別增高3.1倍和2.8倍，而對頭孢曲松和頭孢噻肟的Kcat/Km卻分別降低了1.7倍和2.5倍。 結論： 改組后菌株的TEM型ESBLs活性提高，DNA家族改組是一種有效地改善酶活性的體