Sulfolobus solfataricus P2中的（+）γ-內(nèi)酰胺酶的半理性定向進(jìn)化.pdf

1、來(lái)源于Sulfolobus solfataricus P2(+)γ-內(nèi)酰胺酶(Sslact)是一種理想的生物催化劑，催化（±）γ-內(nèi)酰胺的水解反應(yīng)并產(chǎn)生(-)γ-內(nèi)酰胺，一種能夠用來(lái)合成抗艾滋病藥物abacavir的藥物中間體。
　　采用同源建模和分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法構(gòu)建Sslact的蛋白質(zhì)分子模型，并通過(guò)結(jié)構(gòu)分析，推測(cè)出了催化三聯(lián)體、疏水口袋和對(duì)活性中心的框架起重要作用的氨基酸(3RFA)。催化三聯(lián)體中的Ser195的羥基氫原子

2、到底物的羰基氧原子之間的距離d1和Cys145羰基氧原子到底物的氨基氫原子之間的距離d2被認(rèn)為是用來(lái)推測(cè)是否可獲得高酶活突變體的兩個(gè)重要參數(shù)。我們通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)了幾個(gè)位于疏水結(jié)合口袋和3RFA的氨基酸替換，并利用距離評(píng)價(jià)假說(shuō)推測(cè)出疏水口袋和3RFA的不可變性，最終選擇了遠(yuǎn)離活性中心的Va1203、Pro377和Tyr388作為了突變熱點(diǎn)，以期獲得酶活提高的突變體。
　　通過(guò)易錯(cuò)PCR(epPCR)、定點(diǎn)突變(sdm)和定點(diǎn)飽和

3、突變(ssm)這些定向進(jìn)化方法獲得了一系列突變體，其中包含了幾個(gè)酶活提高的陽(yáng)性突變體V203N、V203Q、Y388H，它們的比酶活分別是418.20 U/mg、373.35 U/mg和1132.87 U/mg，高于野生型菌株(Wild Type/WT)的202.97U/mg。對(duì)其結(jié)構(gòu)和酶活的關(guān)系進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)這些突變體均能夠分別從不同層面證實(shí)了計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的可靠性。
　　為獲得酶活更高的突變體，把兩個(gè)突變位點(diǎn)結(jié)合起來(lái)構(gòu)建了雙