定向進化提高鹵代醇脫鹵酶HHDH的催化活性.pdf

1、利用鹵代醇脫鹵酶催化(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯的脫鹵氰化反應，制備(3R,5R)-6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯具有重要的意義，后者作為他汀類藥物制備的關鍵手性中間體，其合成已經成為生物催化與轉化領域研究的熱點，具有良好的發(fā)展?jié)摿蛻们熬啊?br>　　本文采用易錯PCR定向進化鹵代醇脫鹵酶HHDH，構建突變基因文庫。以(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯為底物，經過初篩和復篩得到活力明顯提高的突變

2、酶:W86R/R87P，A82M/W86R，A82T/W86R和V84T/W86R，其催化活力分別是原始蛋白的1.81、1.80、2.27和2.42倍。由于獲得的陽性突變子上均含有相同的突變點W86R，因此構建了W86R單點突變酶HHDH R，發(fā)現其比活是原始酶的3.75倍。動力學研究表明HHDH_R的Vmax值和Km值分別是263μM/min和4.5 mM，HHDH的Vmax值和Km值分別是249μM/min和6.82 mM。通過分子

3、模擬和對接發(fā)現，在W86突變成Arg之后，酶與底物之間的親和力增加，空間位阻減小，提高了催化效率。
　　隨后根據文獻報道并結合分子模擬得到的突變位點信息，利用飽和突變改造HHDH的86'位點及一些關鍵氨基酸殘基。得到的陽性突變子有W86I，W86L和W86V，比活分別是原始蛋白的9.42，7.25和6.96倍，W86A的比活力僅是HHDH的3.3倍。其中突變酶W86I的比活最高，為0.65 U/mg，Vmax值和Km值分別是328