鹵醇脫鹵酶HheC的固定化研究.pdf

1、工業(yè)酶在工業(yè)生產(chǎn)中扮演著重要角色。鹵醇脫鹵酶HheC是一種從農(nóng)桿菌Agrobacterium radiobacter AD1中提取的新型工業(yè)酶,已有的研究表明該酶具有巨大的工業(yè)和醫(yī)藥學(xué)應(yīng)用前景,它既可以催化有毒害的有機鹵化物如1,3-二氯-2丙醇降解為低毒性的產(chǎn)物環(huán)氧丙烷,又可以催化一些手性藥物中間體如(R)-4-氰-3-丁酸酯的合成。但是游離狀態(tài)的HheC的理化性質(zhì)不穩(wěn)定,對酸堿、溫度、鹽濃度等環(huán)境變化十分敏感,極易變性失活。為了提高

2、酶的性能以及應(yīng)用范圍而將固定化酶技術(shù)用于酶學(xué)研究可極大地提高工業(yè)酶的應(yīng)用范圍。
　　本論文通過采用物理吸附法、物理包埋法以及化學(xué)共價結(jié)合方法對HheC進行固定化研究,找到了針對HheC較為合適的固定方法。首先采用活化硅膠作為吸附載體進行固定,研究發(fā)現(xiàn)該方法雖然操作簡便且根據(jù)以往報道成功率較高,卻不適合HheC的固定,酶蛋白結(jié)合到載體上活性大幅喪失;之后應(yīng)用海藻酸鈣法為載體對酶和細(xì)胞進行包埋固定,研究優(yōu)化了經(jīng)典的方案以適應(yīng)實際的實驗

3、需要,制備的固定化細(xì)胞可以成功地提高熱穩(wěn)定性約120倍左右,而且發(fā)現(xiàn)固定化之后對2-氯-1-苯基乙醇的對映體選擇性仍然較好;但此方法制備的固定化載體穩(wěn)定性較差,載體良好的吸水性能使其容易膨脹破裂,從而導(dǎo)致內(nèi)部的酶分子釋放到環(huán)境中,使固定化失去了意義。之后我們又對共價連接法進行了研究,采用環(huán)氧功能載體Relizyme403 S進行固定,通過研究優(yōu)化和改進了傳統(tǒng)的固定化方案,簡化了復(fù)雜的固定化酶制備工藝,制備的固定化酶可提高其熱穩(wěn)定性至少5