基于定向進化方法改進鹵醇脫鹵酶HheC的熱穩(wěn)定性.pdf

1、鹵醇脫鹵酶可以通過分子內親核取代機制來催化鄰鹵醇和環(huán)氧化物之間的相互轉化，而且它的催化反應是非常高效高選擇性的。正因為具有這些特點，使得鹵醇脫鹵酶可以廣泛應用在手性藥物及精細化工合成領域中，用來合成具有光學純的高價值化學中間體。然而，由于工業(yè)生產條件的苛刻，鹵醇脫鹵酶對極端條件尤其是高溫不具有耐受性，使其在工業(yè)生產中不能夠很好的發(fā)揮其催化性能。為此，我們采用蛋白質工程手段來提高鹵醇脫鹵酶的熱穩(wěn)定性。由于蛋白質的熱穩(wěn)定性往往受多種因素影響

2、，很難采用理性設計的方法來實現(xiàn)，因此本文采用定向進化方法對鹵醇脫鹵酶的熱穩(wěn)定性進行改造研究。
　　本研究中，結合已有鹵醇脫鹵酶的酶活力篩選方法的篩選效率，我們首先采用大引物易錯PCR的方法構建了一個低突變頻率（2-3 a.a. mutation/gene）文庫。在篩選了2000多個克隆后，我們最終得到了6個突變體包含8個突變位點，且這些突變體在55℃下處理100 min后的殘余活性比野生型提高15倍左右。為了進一步提高突變體的熱穩(wěn)

3、定性，我們采用迭代定點飽和突變（ISM）策略對得到的位點進行疊加。通過篩選2200個突變體后，我們得到了一系列熱穩(wěn)定性更高的突變體，其中最好的突變體Var4在65℃條件下t1/2比野生型提高3400倍，并且在75℃下放置30 min后仍然保留75％的殘余活性。穩(wěn)態(tài)動力學和動力學拆分實驗結果顯示，兩個最好的突變體Var3和Var4并沒有因為突變位點的引入而影響了其活性，而且對二氯一苯基乙醇的對映體選擇性并未有較大的影響。相關結構分析結果表