擴(kuò)展青霉脂肪酶熱穩(wěn)定性的分子突變.pdf

1、本研究利用定點(diǎn)突變和隨機(jī)突變的方法，對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶（Penicilliumexpansum lipase，PEL）進(jìn)行了蛋白質(zhì)工程改造。
　　 1.PEL的定點(diǎn)突變
　　 采用重疊延伸PCR的方法，對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶進(jìn)行多個(gè)點(diǎn)突變，選取了十一個(gè)突變位點(diǎn)，構(gòu)建了7個(gè)單點(diǎn)突變體和8個(gè)疊加突變體（與隨機(jī)突變體ep8疊加）。將獲得的突變基因在畢赤酵母中表達(dá)，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。
　　 （1）P197E的單點(diǎn)突變及疊加突

2、變：PEL-P197E酶活為556U/mL，Tm值比野生型提高了0.9℃。PEL-ep8-P197E酶活為592U/mL，其Tm值比野生型脂肪酶PEL的提高2.8℃，比隨機(jī)突變體PEL-ep8提高2.2℃；此外，疊加突變體PEL-ep8-P197E的底物特異性發(fā)生了改變。
　　 （2）K152R的單點(diǎn)突變及疊加突變：PEL-K152R酶活為530U/mL，PEL-ep8.K152R酶活為416U/mL，二者的熱穩(wěn)定性與與野生型無

3、明顯差別。
　　 （3）P102L的單點(diǎn)突變及疊加突變：PEL-P102L酶活為300U/mL。PEL-ep8-P102L的酶活為612U/mL，最適作用溫度提高了5℃，Tm比野生型提高了3.6℃，比隨機(jī)突變體提高了2.6℃。
　　 （4）N166D的單點(diǎn)突變及疊加突變：PEL-N166D、PEL-ep8.N166D的酶活分別為236 U/mL、252U/mL，PEL-ep8-N166D的Tm比野生型PEL下降1.1℃，

4、比隨機(jī)突變體下降2.1℃。
　　 （5）P163A的疊加突變：PEL-ep8-P163A的酶活比野生型降低6.3％，比隨機(jī)突變體降低33.8％；其Tm比野生型PEL提高了1.0℃，與隨機(jī)突變體一致。
　　 （6）K120R、M193V的疊加突變：PEL-ep8-K120R的最適作用降低了5℃；酶活降低較明顯；熱穩(wěn)定性比野生型降低1.5℃，比隨機(jī)突變體PEL-ep8降低2.5℃。PEL-ep8-M193V的酶活很低，僅有4

5、0 U/mL。
　　 （7）G205A、K94D、K94R、W169N的單點(diǎn)突變：PEL-G205A、PEL-K94D、PEL-K94R、PEL-W169N在YPOM板上均沒產(chǎn)生明顯的透明圈。
　　 2.PEL的隨機(jī)突變
　　 通過易錯(cuò)PCR的方法對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶進(jìn)行隨機(jī)突變，經(jīng)過平板透明圈法的初篩和搖瓶復(fù)篩獲得兩株熱穩(wěn)定性有所提高的突變體HR2、HR3。
　　 HR2的酶活為498UJ/mL，Tm值為3

6、9.3℃，比野生型脂肪酶PEL的提高了0.6℃。測序結(jié)果表明：HR2突變體脂肪酶基因第246位的A突變?yōu)镚，即脂肪酶的第82位的Lys（AAG）突變?yōu)锳rg（AGG），同時(shí)還產(chǎn)生了一個(gè)同義突變，第790位的T突變?yōu)镃，即編碼Ala的基因由GCT突變?yōu)镚CC。
　　 HR3的酶活為552U/mL，Tm值為42.1℃，比野生型脂肪酶PEL的提高了3.4℃。測序結(jié)果表明：HR3突變體脂肪酶基因第204位的T突變?yōu)镃，即脂肪酶的第68位

7、的Leu（CTC）突變?yōu)镻ro（CCC）；第426位的A突變?yōu)镚，即脂肪酶的第142位的Lys（AAG）突變?yōu)锳rg（AGG）。
　　 綜上，本研究通過定點(diǎn)突變共構(gòu)建了15個(gè)脂肪酶突變體，獲得了兩株較好的突變體：①PEL-ep8-P197E的熱穩(wěn)定性在隨機(jī)突變體PEL-ep8的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高了2.2℃，比野生型PEL提高了2.8℃，酶活為592U/mL。②PEL-ep8-P102L的熱穩(wěn)定性在隨機(jī)突變體PEL-ep8的基礎(chǔ)上