鹵醇脫鹵酶HheA的改造和生物催化特性的研究.pdf

1、鹵醇脫鹵酶可以催化鄰鹵醇脫鹵及非自然親和試劑介導(dǎo)的環(huán)氧化物 Cβ開(kāi)環(huán)反應(yīng)，因此可用于降解環(huán)境污染物和合成手性β-取代醇，具有很高的工業(yè)應(yīng)用前景。盡管野生型HheC對(duì)短鏈底物具有很高的催化活性的對(duì)R型底物的立體偏好性，對(duì)其改造得到的優(yōu)秀突變體也已用于化工生產(chǎn)，目前仍缺少對(duì)長(zhǎng)鏈底物具有高催化活性和高S型立體偏好性的突變體，這限制了鹵醇脫鹵酶在工業(yè)應(yīng)用中的使用范圍。野生型 HheA是獲得此種突變體的一個(gè)很好的改造模板。雖然 HheA與HheC

2、序列相似度很低，但它們的三維結(jié)構(gòu)非常相似。本文綜合對(duì)HheA和HheC的三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理的研究，發(fā)現(xiàn)HheA具有與HheC類(lèi)似的三個(gè)參與組成活性位點(diǎn)的Loop結(jié)構(gòu)。本文聚焦于此三個(gè)Loop結(jié)構(gòu)上，對(duì)HheA進(jìn)行了結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的“半理性”進(jìn)化。突變體文庫(kù)的篩選是酶進(jìn)化中難以避免卻又往往費(fèi)時(shí)費(fèi)力的步驟，在對(duì)HheA進(jìn)行改造的過(guò)程中，本文提出了高效率的“small-intelligent”飽和突變方法來(lái)構(gòu)建HheA的飽和突變文庫(kù)，此方法通過(guò)合理

3、設(shè)計(jì)突變引物來(lái)縮小突變體文庫(kù)的體積，減小文庫(kù)篩選的工作量。對(duì)HheA的改造最終得到了數(shù)個(gè)具有高催化活性和立體選擇性的突變體，其中的最優(yōu)突變體HheAN178A對(duì)脫鹵反應(yīng)的催化活性比野生型提高了5倍，對(duì)S型底物的立體偏好性較野生型提高了100倍以上（Ecal.值從2提高到200以上）；對(duì)環(huán)氧化物Cβ開(kāi)環(huán)反應(yīng)的S型底物立體偏好性提高到野生型的50倍以上，其在脫鹵和開(kāi)環(huán)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)拆分中均具有很高的對(duì)映體過(guò)量百分?jǐn)?shù)（e.e.≥93％）。通過(guò)對(duì)