亞油酸異構(gòu)酶相關(guān)性及定向進(jìn)化菌株構(gòu)建和酶性質(zhì)的研究.pdf

1、共軛亞油酸（Conjugated Linoleic Acid, CLA）是一類由不同位置和幾何異構(gòu)體組成的擁有兩個(gè)共軛雙鍵的十八碳二烯酸。它廣泛存在于多種食物中，CLA具有多種生理活性，但不同類型的CLA生理活性不盡相同。本研究從兩種亞油酸異構(gòu)酶的克隆表達(dá)入手，比較兩者差異，探索一種通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)與綠色熒光蛋白標(biāo)簽質(zhì)粒聯(lián)合篩選正突變子的快速篩選方法，優(yōu)化突變酶的產(chǎn)酶條件，提高t10, c12-CLA產(chǎn)量，研究突變酶的分離純化條件和酶學(xué)性

2、質(zhì)，并將其應(yīng)用于發(fā)酵乳中。
　　克隆了兩種亞油酸異構(gòu)酶基因lai-l（ORF1776bp）和lai-p（ORF1275bp）。測(cè)序后比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們與相應(yīng)的羅伊氏乳桿菌和痤瘡丙酸桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因相似性為100％，說(shuō)明兩段基因未發(fā)生突變。lai-l與瑞士乳桿菌和加氏乳桿菌的亞油酸異構(gòu)酶基因相似性為93%，兩段基因彼此之間同源性很低。lai-l編碼591個(gè)氨基酸，蛋白命名為L(zhǎng)AI-L，分子量為67.9kD，等電點(diǎn)pI=7.14，預(yù)測(cè)

3、為親水性穩(wěn)定蛋白。它有11個(gè)Ser，8個(gè)Thr，8個(gè)Tyr可能成為蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)，可能是膜上的受體或者定位于膜上；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以不規(guī)則卷曲為主達(dá)47.88%，α-螺旋占34.86%，β-折疊占17.26%。lai-p編碼424個(gè)氨基酸，蛋白命名為L(zhǎng)AI-P，分子量為49.0kD，等電點(diǎn)pI=4.81；預(yù)測(cè)為親水性不穩(wěn)定蛋白。它有3個(gè)Ser，4個(gè)Thr，7個(gè)Tyr可能成為蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)，該蛋白應(yīng)該是細(xì)胞外蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以不

4、規(guī)則卷曲為主達(dá)45.28%，α-螺旋占36.32%，β-折疊占18.4%。
　　將兩種亞油酸異構(gòu)酶分別在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)的蛋白 LAI-L和LAI-P大小約為64kD和55kD；利用易錯(cuò) PCR法突變 lai-p，構(gòu)建標(biāo)簽表達(dá)載體pCold-yclai-p-gfp，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)篩選正突變菌株，準(zhǔn)確率達(dá)82.3%（其中7株突變菌的亞油酸異構(gòu)酶的蛋白序列改變了一個(gè)氨基酸；4株突變菌的蛋白序列改變了2個(gè)氨基酸；M955蛋白序列改變

5、了4個(gè)氨基酸，共發(fā)生7個(gè)堿基位點(diǎn)的突變）。其最佳誘導(dǎo)時(shí)間為18h，最佳誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.2mmol/L，經(jīng)氣相色譜鑒定M955產(chǎn)t10, c12-CLA，產(chǎn)量為68.3±2.1μg/mL。
　　突變亞油酸異構(gòu)酶最佳發(fā)酵時(shí)間為18h，最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2mmol/L，最佳裝液量為20%，最佳培養(yǎng)基初始pH為7，最佳誘導(dǎo)前生物量為OD600=0.4，最佳底物濃度為0.5mg/mL，最佳離子濃度為0.02%的離子。響應(yīng)曲面

6、法優(yōu)化最佳產(chǎn)酶條件為發(fā)酵時(shí)間19.5h，誘導(dǎo)前生物量OD600=0.47和LA濃度0.57mg/mL，亞油酸異構(gòu)酶催化 LA轉(zhuǎn)化為CLA最大量為143.33μg/mL。采用親和層析法對(duì)突變酶進(jìn)行分離純化，最佳流速為0.25 mL/min，最佳上樣量為10 mL，純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)可達(dá)到電泳純。
　　研究突變酶的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)：米氏方程為y=0.0224x+0.0786 R2=0.9972，計(jì)算得 Km為0.285mg

7、/mL，Vmax為12.72U/mg。酶的最適反應(yīng)溫度為37℃、溫度穩(wěn)定范圍為0～40℃、最適反應(yīng) pH為7.0、pH穩(wěn)定范圍為pH5.0～9.0之間、最佳底物濃度為0.5mg/mL、金屬離子對(duì)亞油酸異構(gòu)酶的活性沒有顯著影響。
　　將未突變和突變后的痤瘡丙酸桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化到嗜熱鏈球菌中。研究發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌紅霉素的敏感閾值為7.5μg/mL，當(dāng)甘氨酸濃度為1%、菌體生長(zhǎng)至OD600=0.8、轉(zhuǎn)化電壓為1.8kV、質(zhì)粒濃度為