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文檔簡介
1、分類號Q93學校代碼10129UDC579學號08210001植物乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因的定點突變研究SiteDirectedMutagenesisofLinoleateIsomeraseGenefromLactobacillusPlantarum申請人:劉海霞學科門類:理學學科專業(yè):微生物學研究方向:微生物分子生物學指導教師:趙國芬教授論文提交日期:二〇一一年五月摘要共軛亞油酸(conjugatedlinoleicacids簡稱CLA
2、)是一種具有多種生理活性的天然脂肪酸,CLA具有抗癌、降低膽固醇、增強機體免疫力等多種生理功能。亞油酸異構(gòu)酶可將亞油酸轉(zhuǎn)化為生物活性的CLA。目前,亞油酸異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究以及利用生物工程和基因工程對亞油酸異構(gòu)酶進行有效地改造已成為熱點。但是在微生物發(fā)酵生產(chǎn)CLA的代謝途徑和機理方面研究甚少,有待進一步深入研究。本實驗以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumP8)基因組為模板,設(shè)計引
3、物,通過PCR擴增得到亞油酸異構(gòu)酶基因,將其克隆到pMD19T載體測序鑒定后,再亞克隆到表達載體pQE30中,雙酶切鑒定表達載體pQE30LAI成功構(gòu)建。用:www.ncbinlm.nih.govblast和vecterNTI等軟件工具對亞油酸異構(gòu)酶進行生物信息學分析并預測酶關(guān)鍵氨基酸,預測結(jié)果確定亞油酸異構(gòu)酶的必要氨基酸為193位苯丙氨酸,將其定為突變位點,改變578位堿基T為C,將苯丙氨酸極性氨基酸突變?yōu)榉菢O性氨基酸絲氨酸。設(shè)計突變
4、引物,以重組質(zhì)粒pQE30LAI為模板,用Transgen公司開發(fā)的QuickChange定點突變試劑盒進行定點突變,成功構(gòu)建突變載體pQE30F193LAI。突變前后的亞油酸異構(gòu)酶在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導表達,分別用提取的粗酶和菌體直接催化測定酶活力,酶催化的結(jié)果分別為野生型1999.79Uml,突變型1564.53Uml,菌體催化的結(jié)果分別為野生型117.11Uml,突變型87.96Uml。兩種結(jié)果均表明,重組菌pQE30LAI的
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