產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株誘變選育及酶的分離純化.pdf

1、β-葡萄糖苷酶通過水解末端非還原性β-D-糖苷鍵，釋放出β-D-葡萄糖和其相應(yīng)的配基，在自然界中存在廣泛。不同來源的β-葡萄糖苷酶在生物能源、食品工業(yè)、保健品、農(nóng)業(yè)和其它領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。尤其作為纖維素酶系中的關(guān)鍵組分，β-葡萄糖苷酶在纖維素降解過程中起著重要的作用。但是目前纖維素酶生產(chǎn)菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶含量普遍較低，因此培育高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株具有重要的意義。本研究選用實(shí)驗(yàn)室保藏的一株草酸青霉菌C2'作為出發(fā)菌株，主要取

2、得以下研究成果:
　　通過對(duì)原始菌株C2'進(jìn)行硫酸二乙酯和紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變，運(yùn)用剛果紅平板篩選出誘變菌株草酸青霉菌901B2，其發(fā)酵5d產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活為0.69IU/mL，是出發(fā)菌株的2.16倍。
　　菌株901B2液體發(fā)酵培養(yǎng)8d發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶酶活最高可達(dá)1.14IU/mL;采用單因素法對(duì)誘變菌株901B2發(fā)酵過程中的最適碳源、氮源、無機(jī)鹽、表面活性劑和初始pH進(jìn)行了試驗(yàn);結(jié)合中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分

3、析方法，得到培養(yǎng)基中影響β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量兩個(gè)顯著因素麩皮和硫酸銨的含量分別為41.40g/L和3.11g/L，并通過模型預(yù)測(cè)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活最大值為1.74IU/mL;最終優(yōu)化后的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麩皮41.40g/L，(NH4)2SO43.11g/L，KH2PO42.0g/L,MgSO4·7H2O0.40g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.40g/L，吐溫-801.0％;經(jīng)過驗(yàn)證，突變株901B2最終產(chǎn)β-葡萄糖

4、苷酶酶活為1.71IU/mL，與響應(yīng)面法優(yōu)化前的β-葡萄糖苷酶活1.14IU/mL比較提高了50.0％，并接近于模型預(yù)測(cè)值。
　　采用乙醇分級(jí)沉淀和HiTrapSPXL強(qiáng)陰離子交換層析對(duì)發(fā)酵粗酶液中的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了分離純化，純化后的比活力比粗酶液提高了9.89倍，β-葡萄糖苷酶的回收率為11.89％，最終經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證分離純化后的β-葡萄糖苷酶組分達(dá)到了電泳純，經(jīng)雙向電泳分離得到分子量大小與SDS-PAGE電泳結(jié)果較

5、為一致且具有較高表達(dá)量的目標(biāo)蛋白質(zhì)點(diǎn)。
　　酶學(xué)分析結(jié)果表明誘變菌株草酸青霉菌901B2所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度為60℃，在40～60℃保溫處理120min后均具有良好的熱穩(wěn)定性;最適反應(yīng)pH值為5.0，在pH3.0～6.0的酸性條件下處理24hrs仍具有較高的酶活性;Mn2+和Fe2+對(duì)β-葡萄糖苷酶活力具有較明顯的促進(jìn)作用，Mg2+、Ca2+、K+和cu2+對(duì)β-葡萄糖苷酶具有抑制作用;金屬螯合劑EDTA的添加能夠顯著增