OmpA信號肽介導的重組大腸桿菌生產(chǎn)α環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡稱CGT酶,EC2.4.1.19)是糖基水解酶α-淀粉酶家族(家族13)的重要成員,它能通過環(huán)化反應將淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精(簡稱CD)。根據(jù)CGT酶反應起始階段生成環(huán)糊精的主要類型,將CGT酶分為α-、β-和γ-CGT酶。隨著α-環(huán)糊精在食品、分子識別和納米材料等領(lǐng)域的廣泛應用,α-CGT酶已成為當今研究的熱點。
　　 本論文以所在實驗室構(gòu)建并保存的含分泌型信號肽OmpA的大腸桿菌E.coli BL21(DE

2、3){OmpA-pET-20b(+)/α-cgt}為出發(fā)菌株,以高產(chǎn)量、高分泌能力和高生產(chǎn)強度為目標,在搖瓶和3L發(fā)酵罐中研究了發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對α-CGT酶的胞外分泌的影響。本論文主要研究內(nèi)容如下:
　　 1、重組大腸桿菌在種子培養(yǎng)基中的最佳活化時間為6-8h。在搖瓶水平下,在菌體生長的對數(shù)前期添加0.75％(w/v)甘氨酸能有效地提高α-CGT酶的胞外產(chǎn)量,當發(fā)酵至36h時,胞外酶活達18.9U/mL,是同期不添加甘氨酸

3、的2.2倍。在搖瓶水平下,通過一系列單因素實驗優(yōu)化出的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:甘油10g/L,工業(yè)級蛋白胨18g/L,工業(yè)級酵母粉20g/L,K2HPO4·3H2O16.43 g/L,KH2P04.2.31 g/L,MgCl25mM,初始pH為7.0;發(fā)酵條件為:30℃,7％的接種量,裝液量為20mL,培養(yǎng)基/250mL三角瓶。在搖瓶條件下重組大腸桿菌胞外生產(chǎn)α-CGT酶的能力從發(fā)酵60h的20.5U/mL提高到發(fā)酵48h的56.0U/mL,

4、生產(chǎn)強度從341.7U/L/h提高到1166.7U/L/h。
　　 2、采用優(yōu)化后的復合培養(yǎng)基研究3L罐分批發(fā)酵的溶氧及分批-補料發(fā)酵中的誘導劑對重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)α-CGT酶的影響,結(jié)果顯示分批發(fā)酵中的大腸桿菌在30％DO下所得的胞外酶活最高,達到17.8U/mL,分別為同期20％DO和40％DO水平下的1.7和1.2倍。分批-補料發(fā)酵中的大腸桿菌在誘導條件下的產(chǎn)酶狀況比非誘導條件下好,其中采用IPTG誘導時,發(fā)酵30h的胞

5、外酶活達49.7U/mL,是非誘導條件下的1.6倍;采用乳糖誘導時,發(fā)酵27h的胞外酶活達44.0U/mL,是非誘導條件下的1.4倍。
　　 3、在3L罐中研究非誘導條件下合成培養(yǎng)基對重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)α-CGT酶的影響,結(jié)果顯示合成培養(yǎng)基適合菌體的高密度生長,菌體OD600最高達到150.0,但菌體不產(chǎn)酶。為了誘導重組大腸桿菌表達異源蛋白,實驗比較了不同誘導劑、誘導濃度和誘導時間對菌體高密度發(fā)酵生產(chǎn)α-CGT酶的影響,

6、結(jié)果表明:1)在0.5mM IPTG誘導下,菌體在誘導后1h立即開始自溶,胞外無酶活;在8.0g/L/h乳糖誘導下,菌體在誘導后4h內(nèi)繼續(xù)以指數(shù)形式增長,菌體OD600最高為71.1,胞外酶活最高達10.0U/mL。2)菌體在0.8g/L/h乳糖誘導下的胞外酶活最高,發(fā)酵27h的胞外產(chǎn)量達46.44U/mL,分別是0.4g/L/h和8.0g/L/h的1.8倍和4.6倍。3)重組大腸桿菌在OD600=50誘導所得的胞外酶活最高,分別為OD

7、600=25和100誘導的5.5倍和66.3倍。
　　 4、在3L罐中研究補料液中的氮源以及誘導溫度對重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)α-CGT酶的影響。結(jié)果顯示:1)菌體在含有機氮源的補料液中發(fā)酵所得胞外酶活最高,為105.1U/mL,是對照實驗的2.3倍;在含無機氮源的補料液中發(fā)酵所得胞外酶活最低,為8.8U/mL,僅為對照實驗的19.O％。2)菌體在25℃誘導下發(fā)酵35h所得胞外酶活最高,達275.3U/mL,是20℃和30℃誘