糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶

1、第八章 糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶,第一節(jié) 糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferases),糖基轉(zhuǎn)移酶是一系列參與催化雙糖、聚糖和糖復(fù)合物中糖鏈合成的一類酶。負(fù)責(zé)將活性供體(通常是NDP-糖)的單糖轉(zhuǎn)移到糖、蛋白質(zhì)、脂類、核酸分子上，完成糖基化反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)的糖基轉(zhuǎn)移酶有100多種，其主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。,一、糖基轉(zhuǎn)移酶的命名與分類,糖基轉(zhuǎn)移酶的傳統(tǒng)分類方法是根據(jù)其所轉(zhuǎn)移的單糖類型進(jìn)行分類的。如半乳糖轉(zhuǎn)移酶，唾液酸轉(zhuǎn)移酶等

2、。另外一種方法是根據(jù)序列的同源性、底物/產(chǎn)物立體化學(xué)異構(gòu)性以及供體糖進(jìn)行分類。這種分類法糖基轉(zhuǎn)移酶被分為66個(gè)家族及一個(gè)未分類族。所有家族只采用兩種折疊方式，形成了兩個(gè)超家族，分別為GT-A和GT-B超家族。,糖基轉(zhuǎn)移酶的命名,GlcNAc T-I的全稱為：UDP-N-乙酰葡糖胺:?-3-甘露糖基?-1,2N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。GlcNAc T-II的全稱為：UDP-N-乙酰葡糖胺: ?-6-甘露糖基?-1,2N-乙酰葡糖胺

3、轉(zhuǎn)移酶。,?-1,4-Galactosyltransferase Family,Fucosyltransferase Family,All members of the sialyltransferase genes cloned,The Evolutionary History of Glycosyltransferase Genes,后生動(dòng)物,后口動(dòng)物,脊椎動(dòng)物,哺乳動(dòng)物,原始昆蟲(chóng),無(wú)脊椎動(dòng)物,非哺乳動(dòng)物,二、糖基轉(zhuǎn)移酶特性,一個(gè)基

4、因 ? 一種轉(zhuǎn)移酶 ? 一種連接鍵糖鏈的合成不是由基因編碼合成的，而是由基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)糖基化作用，將糖基由其供體轉(zhuǎn)移到受體上完成的。每個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶都有自己特異供體、受體和聯(lián)接鍵，這就保證了在沒(méi)有模板的情況下合成特異性的糖。糖鏈可以認(rèn)為是基因的次級(jí)產(chǎn)物, 一個(gè)基因編碼一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶, 一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶專一地催化一個(gè)糖苷鍵的合成，一條糖鏈的合成就需要一個(gè)多酶系統(tǒng), 也就對(duì)應(yīng)了一個(gè)基因組。,糖基轉(zhuǎn)移酶特性,糖基轉(zhuǎn)移酶絕大部分是

5、II型膜結(jié)合蛋白，即較短的N-端在胞漿，有一穿膜部分通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體膜，長(zhǎng)的C-端在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的管腔內(nèi)。有少數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶是I型膜結(jié)合蛋白，其較短的N-端在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而很長(zhǎng)的C-端則定位于胞漿。,Biological Functions of a Soluble Form of N-acetylglucosaminyltransferase V (GnT-V),Regulation of High Branching in

6、 N-linked Oligosaccharides,大鼠不同組織中三種Ｎ-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶(GlcNAc T),三、糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域,屬于II-型膜結(jié)合蛋白的糖基轉(zhuǎn)移酶分成四個(gè)結(jié)構(gòu)域。氨基端的胞漿域，一般少于25個(gè)(最少4個(gè))氨基酸，含正電荷的堿基氨基酸較多；穿膜域，有少量氨基酸殘基，富含疏水氨基酸；頸區(qū)域，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體管腔內(nèi)，含甘氨酸和脯氨酸殘基，有的帶有N-糖鏈。,糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域,催化域，為管腔中的最大結(jié)構(gòu)域

7、，呈球狀，約含310-430個(gè)(最長(zhǎng)可達(dá)720個(gè)左右)氨基酸殘基，為糖基轉(zhuǎn)移酶最重要的催化區(qū)域。,克隆的哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域,四、糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性與功能,(1)底物專一性糖復(fù)合物中糖基的順序和連接鍵是由糖基轉(zhuǎn)移酶的底物專一性和催化特性來(lái)決定的。對(duì)底物專一性，一個(gè)酶的產(chǎn)物常作為下一個(gè)酶的底物，這樣就保證了糖鏈中糖基的特定順序。因合成的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同或合成的部位不同，所用的供體和受體也不同。,糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性,合成糖原時(shí)，

8、葡萄糖的供體是UDP-Glc，合成淀粉時(shí)，則是ADP-Glc，合成纖維素時(shí)是GDP-Glc。對(duì)受體的專一性，在糖蛋白的N-糖苷鍵連接的糖鏈的外周有6種不同的方式連接的N-乙酰葡糖胺(GIcNAc),它們連接在不同甘露糖基(Man)的不同糖基上，分別有6個(gè)不同的糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)它們的轉(zhuǎn)移，每個(gè)酶又對(duì)應(yīng)不同的受體 。,不同的糖基轉(zhuǎn)移酶所催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)不同,人B血型的?1-3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)受體底物的專一性,糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性,唾液酸化

9、Lewis X四糖抗原合成時(shí)，一般先生成唾液酸化的N-乙酰乳糖胺，再由?-1,3Fuc T在G1cNAc上加入Fuc，而不能先合成巖藻糖化的N-乙酰乳糖胺后再加上NeuAc。因?-2,3 NeuAc T不能以?-1,3巖藻糖化糖鏈為底物。,糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性,糖基轉(zhuǎn)移酶也可作用于人工底物，如參與糖蛋白糖鏈合成的糖基轉(zhuǎn)移酶也可利已除去蛋白質(zhì)而還原末端標(biāo)記(熒光和放射性核素)的底物。不少糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)底物的識(shí)別實(shí)際上只涉及受體底物中接受糖

10、基鄰近的少數(shù)糖基，故一些人工合成的寡糖衍生物也可作為這些酶的底物。,糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特性,,(2)二價(jià)金屬離子的需求大多數(shù)的糖基轉(zhuǎn)移酶都需二價(jià)金屬離子作為輔助因子，缺乏二價(jià)金屬離子時(shí)(如在EDTA存在下)酶活力很低或喪失。二價(jià)金屬離子中Mn2+的激活作用最強(qiáng)，其次是Co2+,Mg2+,Ni 2+。糖基轉(zhuǎn)移酶 T-V不需要二價(jià)金屬離子。,五、糖基轉(zhuǎn)移酶同源性和抗原性,糖基轉(zhuǎn)移酶在結(jié)構(gòu)上的最大特點(diǎn)是不同糖基轉(zhuǎn)移酶一級(jí)結(jié)構(gòu)之間的同源性很

11、少，即使轉(zhuǎn)移相同糖基的糖基轉(zhuǎn)移酶也很少有同源性。血型A抗原的GalNAc T和血型B抗原的Gal T同源性達(dá)99％，在353個(gè)氨基酸殘基中只有4個(gè)不同。,糖基轉(zhuǎn)移酶同源性和抗原性,不同種屬中同一糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性極大，其催化結(jié)構(gòu)域的同源性一般均在80％以上。如人、小鼠和兔中?-1,2GlcNAc T-I四個(gè)結(jié)構(gòu)域的同源性分別為100%、90%、80%和95%。,六、糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病,?-1,3 T的活性在人體內(nèi)的重現(xiàn)會(huì)引發(fā)自身免疫反

12、應(yīng)。相反，如果人體內(nèi)?-1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活性下降，致使正常的免疫球蛋白G (IgG)分子中的糖鏈半乳糖含量降低。它能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，從而也會(huì)出現(xiàn)自身免疫，其癥狀是類風(fēng)濕。,糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病,細(xì)胞癌變過(guò)程中常伴有糖鏈結(jié)構(gòu)改變，如糖鏈分支末端出現(xiàn)重復(fù)N-乙酰半乳糖胺結(jié)構(gòu)、唾液酸和巖藻糖含量增加，這些變化在臨床上常用作腫瘤標(biāo)記物。糖基轉(zhuǎn)移酶就是通過(guò)影響糖鏈的改變，而間接關(guān)系到癌瘤發(fā)生和發(fā)展。,糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病,糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)和細(xì)胞周

13、期密切相關(guān)。在細(xì)胞分化階段，如果糖基轉(zhuǎn)移酶在成熟細(xì)胞中活性很高，就會(huì)產(chǎn)生癌變，同時(shí)出現(xiàn)早期的分化抗原。多聚N-乙酰半乳糖胺鏈的出現(xiàn)被看成是腫瘤的重要標(biāo)志。這些糖鏈可以減低細(xì)胞與基質(zhì)間的粘著，有利于癌細(xì)胞的進(jìn)一步侵入。,糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病,與肝癌發(fā)生有關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶糖基轉(zhuǎn)移酶在肝癌中活性有明顯改變，如GnT-Ⅳ、GnT-Ⅴ和?-1, 6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。GnT-Ⅳ和GnT-Ⅴ能將一個(gè)N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移至N-糖鏈五糖核心1, 3和1,

14、 6臂甘露糖上,分別形成?-1,4和1,6鍵，使N-糖鏈天線數(shù)增多，?-1, 6 FucT則將巖藻糖轉(zhuǎn)移至糖鏈最內(nèi)側(cè)(與天冬酰胺相鄰)的N-乙酰葡糖胺上形成核心巖藻糖。,糖基轉(zhuǎn)移酶和疾病,這些結(jié)構(gòu)異常的糖鏈出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的糖蛋白上，使腫瘤細(xì)胞表面性質(zhì)變化，導(dǎo)致細(xì)胞粘附、侵襲和遷移能力改變，是造成腫瘤細(xì)胞具有侵襲性和轉(zhuǎn)移能力的一個(gè)重要原因。,七、糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用,糖基轉(zhuǎn)移酶在肝癌研究中的應(yīng)用惡性腫瘤中糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)及活性改變所致腫瘤細(xì)胞

15、表面糖鏈結(jié)構(gòu)的變化在腫瘤的診斷、預(yù)防方面有重要意義。將糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞，過(guò)表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶使細(xì)胞內(nèi)某些蛋白發(fā)生糖基化,產(chǎn)生不同糖型，通過(guò)雙向電泳和凝集素免疫印跡相結(jié)合，比較轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組糖蛋白改變，從而確定蛋白質(zhì)和糖基化的功能關(guān)系,研究為糖基化改變?cè)诟伟┌l(fā)生中的作用研究奠定了基礎(chǔ)。,糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用,采用同樣技術(shù)路線研究與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的糖基化改變，并從結(jié)構(gòu)上描述糖鏈，旨在將其作為乳腺癌和其他實(shí)體腫瘤診斷工具和免疫治療靶

16、點(diǎn)。,糖基轉(zhuǎn)移酶在糖類合成中的應(yīng)用糖類藥物在治療炎癥、用作腫瘤疫苗和抗病毒等方面都有其獨(dú)特的功效。現(xiàn)在普遍使用的糖類合成方法有兩種： 化學(xué)合成和酶促合成化學(xué)合成近年來(lái)取得一些進(jìn)展，提出了一種全自動(dòng)寡糖合成法，但在天然復(fù)合產(chǎn)物中以一種糖代替另一種糖仍然困難。酶促合成的產(chǎn)量高、產(chǎn)物具有特異立體化學(xué)異構(gòu)性。,糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用,糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用,糖基轉(zhuǎn)移酶可作為研究糖復(fù)合物工具如研究糖蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及細(xì)胞表面糖基化修

17、飾等。,八、O-GlcNAc 糖基轉(zhuǎn)移酶在原核和真核細(xì)胞中的表達(dá)和提純,南通醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室與美國(guó)紐約州立基礎(chǔ)研究所神經(jīng)生化系合作。O-GlcNAc 糖基化修飾起到調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性，在生命過(guò)程的許多方面起作用(如核運(yùn)輸，基因轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程)。OGT 基因敲除實(shí)驗(yàn)表明蛋白質(zhì)O-GlcNAc 糖基化修飾是胚胎干細(xì)胞存活和個(gè)體發(fā)育所必需的。蛋白質(zhì)的O-GlcNAc 糖基化修飾還調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化，蛋白質(zhì)的O-GlcNAc 糖基化與磷

18、酸化修飾間存在相互競(jìng)爭(zhēng)、相互補(bǔ)充的關(guān)系。,細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化和去糖基化分別由O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)和O-GlcNAc 糖苷酶催化。蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化修飾及其生物學(xué)意義目前成了蛋白質(zhì)翻譯后修飾領(lǐng)域最熱門(mén)的課題之一。其研究目的：用原核和真核細(xì)胞表達(dá)OGT，并用不同的方法從這兩個(gè)系統(tǒng)提純重組OGT，獲得制備有活性的OGT，用于進(jìn)行O-GlcNAc糖基酶功能方面的研究。,研究結(jié)果,用大

19、腸桿菌和Hi5 昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)并純化具有活性的重組OGT。攜帶人OGTcDNA的PET 32a 質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)出帶有1個(gè)S-Tag 的重組人OGT 融合蛋白，然后用與S-蛋白質(zhì)偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠顆粒從細(xì)菌裂解液中親和層析純化得到OGT 融合蛋白。其純化的OGT在電泳中顯現(xiàn)單一條帶并具有生物活性，但其活性在洗脫后喪失。,IPTG 誘導(dǎo)重組OGT 在BL 21 大腸桿菌中的表達(dá),大腸桿菌中表達(dá)的重組OGT 經(jīng)S-蛋白質(zhì)凝膠純化,研究結(jié)

20、果,在Hi5 昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的鼠肝OGT，經(jīng)鎳離子螯合柱純化后, 其比活性達(dá)到0.88 nmol·min-1·mg-1OGT。,Hi5 細(xì)胞中表達(dá)的重組OGT 的純化,甜菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及序列分析,利用與植物次生代謝產(chǎn)物糖基化相關(guān)的UDPG糖基轉(zhuǎn)移酶的特征性保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了同源引物。以甜菊基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增獲得甜菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段。根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)引物GSTr 和GSTf ，分別與c

21、DNA文庫(kù)的T3 和T7 通用引物擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)核苷酸序列的甜菊糖基轉(zhuǎn)移酶基因。,The level of expression of plant glycosyltransferases,Transgenic pigs with GnT-III,Recombinant plant glycosyltransferases reported recently (2001–2004),葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的實(shí)驗(yàn)研究,葡糖基轉(zhuǎn)

22、移酶是致齲菌的重要致病因素之一， 具有利用蔗糖合成細(xì)胞外葡聚糖的催化活性和結(jié)合葡聚糖的活性，在細(xì)菌附著和菌斑形成的過(guò)程中起著重要作用。抑制GTF活性，減少葡聚糖的產(chǎn)生是控制菌震斑預(yù)防齲病的重要手段之一。目的： 動(dòng)物體內(nèi)研究葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS 免疫原性和防齲效果。,葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的實(shí)驗(yàn)研究,方法： 構(gòu)建大鼠人工齲模型，分別用人工抗原HDS-KLH，多肽抗原HDS，葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)免疫大鼠，酶

23、聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清和唾液中抗HDS、GTF抗體；體視顯微鏡下觀察各組大鼠磨牙齲壞情況，并用Keyes計(jì)分法計(jì)分。,葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的實(shí)驗(yàn)研究,結(jié)果：HDS-KLH免疫組大鼠唾液、血清中抗HDS IgG和IgA 水平均高于對(duì)照組(P <0.05)；HDS-KLH，HDS，GTF免疫組大鼠齲Keyes 計(jì)分均低于對(duì)照組( P < 0101)，光滑面防齲效果最為顯著。結(jié)論：人工抗原 HDS-KLH

24、能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)GTF 的保護(hù)性免疫，并減少實(shí)驗(yàn)大鼠齲齒發(fā)生。,葡糖基轉(zhuǎn)移酶抗體的制備與研究,以葡糖基轉(zhuǎn)移酶免疫產(chǎn)蛋母雞。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定雞蛋黃中免疫球蛋白的活性。經(jīng)葡糖基轉(zhuǎn)移酶免疫后可以得到高效價(jià)的蛋黃抗體，其抗遠(yuǎn)援鏈球菌的效價(jià)約為一般IgY的16倍。 體外模擬實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)遠(yuǎn)援鏈球菌免疫的蛋黃抗體確實(shí)有抗牙菌斑形成的能力，從而具備防齲齒的功效。,第二節(jié) 糖苷酶,糖苷酶(G1ycosidase)是一大類催化糖苷鍵水解的酶

25、類。其主要分布在動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)，擔(dān)負(fù)著水解各種糖苷、寡糖、多糖、復(fù)雜多糖以供機(jī)體利用的生物學(xué)功能。大多數(shù)糖苷酶水解典型O-糖苷鍵，也有部分水解N-糖苷鍵，有一些糖苷酶水解S-糖苷鍵。,一、糖苷酶的分類,按照酶的作用方式和水解產(chǎn)物可把糖苷酶分為兩大類：外切糖苷酶類（Exoglycosidases)： 它們的作用方式是從糖鏈的非還原端開(kāi)始，逐步將糖苷鍵切斷，所得到的水解產(chǎn)物為單糖或雙糖；內(nèi)切糖苷酶類（Endoglyc

26、osidases)： 它們從糖鏈的中間打斷糖苷鍵，水解產(chǎn)物為分子量小于原來(lái)底物的寡糖。,Exo-1-4-Beta-D-Glycanase,二、糖苷酶的分布,糖苷酶在自然界有廣泛分布，幾乎所有動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)都能找到糖苷鍵。在哺乳動(dòng)物中，血清、血細(xì)胞、體液、各種組織器官中都有存在。許多軟體動(dòng)物也是糖苷酶的良好來(lái)源。植物種子里有豐富的糖苷酶。一些細(xì)菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相當(dāng)?shù)难芯繄?bào)道。,三、糖苷酶的命名,糖苷酶的命

27、名與它的底物專一性密切相關(guān)。底物專一性包含：糖基一側(cè)的專一性；糖苷鍵的?-?-異頭專一性；糖苷配基一側(cè)的專一性。糖苷酶的命名是根據(jù)糖基一側(cè)的專一性和糖苷鍵的?-?-異頭專一性來(lái)命名的。?-葡萄糖苷酶、 ?-葡萄糖苷酶、 ?-半乳糖苷酶、 ?-甘露糖苷酶等。,(1)糖基一側(cè)的專一性(2)糖苷鍵的?-?-異頭專一性(3)糖基配基一側(cè)的專一性,四、糖苷酶的生物學(xué)功能,(1)分泌到細(xì)胞外的糖苷酶，參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的胞外消化吸收過(guò)程。

28、(2)細(xì)胞內(nèi)的糖苷酶，如動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的溶酶體中有一系列糖苷酶，它們的功能是降解胞內(nèi)的糖復(fù)合物。(3)參與糖鏈的合成，如在糖蛋白生物合成過(guò)程中，參加N-型糖鏈的“剪枝”， “修剪”成較短分支(Man3GlcNAc-Asn)結(jié)構(gòu)，然后再由糖基轉(zhuǎn)移酶加上新的糖基，形成不同結(jié)構(gòu)的糖鏈。,Biological Roles of N-glycanase in Cells,五、一些常見(jiàn)的糖苷酶,?-D-甘露糖苷酶　?-D-甘露糖苷酶?- D-木

29、糖苷酶?,?-鼠李糖苷酶? -D-葡萄糖苷酶?-D-葡萄糖苷酶： 海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖酶、淀粉麥芽糖酶。 　唾液酸酶(神經(jīng)氨酸酶類)。,一些常見(jiàn)的糖苷酶,?-D-半乳糖苷酶? -D-半乳糖苷酶?-D-N-乙酰半乳糖胺酶? -D-N-乙酰己糖胺酶　 ? -D-N-乙酰葡糖胺酶?-D-N-乙酰半乳糖胺酶? -D-巖澡塘苷酶 ?-L-巖澡塘苷酶,水解不同類型糖苷鍵的糖苷酶,六、糖苷酶的制備方法,黃

30、芪皂苷糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選將篩選用菌株Absida sp. A9r 、A84r 、A9r 、A8r 、A38r 、Arr進(jìn)行培養(yǎng)制備酶液 ? 以黃芪總皂苷為底物進(jìn)行誘導(dǎo) ? 薄層層析法檢測(cè)水解結(jié)果。結(jié)果：A bsida sp. A3r 菌所產(chǎn)酶液能較好的水解黃芪總皂苷中糖基較多的皂苷，進(jìn)而生成糖基較少的皂苷。,綠色木霉產(chǎn)生的外切β-葡聚糖苷酶從潮濕的樹(shù)皮及腐爛的木塊上采集樣本? 加適量的無(wú)菌水溫和攪拌?取1 ml 懸濁液,分別涂于含

31、有濾紙的固體篩選培養(yǎng)基上?待長(zhǎng)出若干菌落后，對(duì)生長(zhǎng)良好的菌種進(jìn)行分離?以羧甲基纖維素鈉為底物分別測(cè)定其所產(chǎn)酶活性。菌培養(yǎng)液過(guò)濾?上清液硫酸銨沉淀?　Sephadex 柱層析?DEAE2纖維素52 陰離子交換柱層析?收集洗脫純酶液。,一株神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)切糖苷酶產(chǎn)生菌的分離采用神經(jīng)節(jié)苷脂選擇性培養(yǎng)基，從土壤微生物中篩選得到一株產(chǎn)神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)切糖苷酶的菌株YW2112，該酶能特異性水解神經(jīng)節(jié)苷脂中連接神經(jīng)酰胺和寡糖鏈之間的糖苷鍵，是研究神經(jīng)

32、節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)與功能的重要工具酶。,人參糖苷酶提取目的： 用于對(duì)人參皂苷進(jìn)行改造的糖苷酶。方法： 從鮮人參根中提取人參皂苷酶，乙醇沉淀，離子交換層析純化，凝膠電泳分析，薄層色譜法測(cè)酶活力。結(jié)果： 經(jīng)離子交換層析得到人參皂苷?-葡糖苷酶。,七、糖苷酶的分離、純化和測(cè)定,糖苷酶的分離純化，在原則和技術(shù)方法上和一般的蛋白質(zhì)或酶的分離純化沒(méi)有區(qū)別。常用的方法： 鹽析(硫酸銨沉淀)、柱層析(離子交換、凝膠過(guò)濾、親和層析、吸

33、附)， 電泳等。,一些糖苷酶的分離純化方法,親和層析法分離純化糖苷酶,糖苷酶活性測(cè)定,糖苷酶活性測(cè)定：(1)最常用的方法是以合成的對(duì)硝基苯酚糖苷化合物作為底物，在酶作用下釋放出的對(duì)硝基苯酚，在堿性條件下呈黃色，可用分光光度計(jì)法定量測(cè)定。(2)把傘形酮類螢光化合物(4-Methyumbelliferone)結(jié)合到神經(jīng)氨酸的半縮醛羥基上，生成4-甲基傘形酮基N-乙酰神經(jīng)氨酸苷，用做神經(jīng)氨酸苷酸的底物。在酶作用下，釋放出發(fā)螢光的4-甲基傘

34、形酮，用360nm波長(zhǎng)光作激發(fā)光，在440nm波長(zhǎng)處測(cè)發(fā)射光，可定量地測(cè)定釋放的4-甲基傘形圈。,糖苷酶活性測(cè)定,(3)需要以合成的或天然的雙糖、寡糖、糖肽甚至糖脂作為底物的方法。有兩種情況：一是測(cè)定糖苷酶作用下從非還原端釋放的單糖。用雙糖?-O-2-L-吡喃巖藻糖基-D-半乳糖為底物。釋放出來(lái)的巖藻糖，可以轉(zhuǎn)變?yōu)槿谆杳蜒苌?，氣相色譜上測(cè)定。,糖苷酶活性測(cè)定,二是在酶作用下，非還原端的糖基釋放后，測(cè)定其余下的部分。采用螢光化

35、合物(?-氨基吡啶, 5-二甲氨基萘磺?；?標(biāo)記在底物糖鏈的還原末端，結(jié)合使用高效液相色譜分離，用螢光分光光度計(jì)檢測(cè)酶活性。,八、糖苷酶的應(yīng)用,在糖鏈結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用作為工具酶的糖苷酶? -D-半乳糖苷酶?-D-N-乙酰半乳糖胺酶? -D-N-乙酰己糖胺酶　 ? -D-N-乙酰葡糖胺酶?-D-N-乙酰半乳糖胺酶? -D-巖澡塘苷酶 ?-L-巖澡塘苷酶,1、作為工具酶的糖苷酶,糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等糖復(fù)合物在生物體內(nèi)，

36、尤其是在細(xì)胞表面攜帶著生物的信息，在分子識(shí)別過(guò)程中起著重要作用。研究其功能，首先要研究其結(jié)構(gòu)。闡明一種糖復(fù)合物的糖鏈結(jié)構(gòu)往往需要綜合運(yùn)用多種技術(shù)方法包括過(guò)碘酸氧化、甲基化反應(yīng)、紅外光譜、核磁共振以及糖苷酶作用等。糖苷酶的使用在糖鏈結(jié)構(gòu)研究主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：,(1)外切糖苷酶的作用特點(diǎn)和底物專一性,通過(guò)糖苷酶水解，能切下非還原末端的一個(gè)單糖，同時(shí)提供關(guān)于糖基的組成、排列順序以及糖苷鍵的?-或?-異頭構(gòu)型的信息。糖基組成，用糖

37、鏈完全酸水解，加上紙色譜或氣相色譜分析得到的結(jié)果，可以和應(yīng)用糖苷酶所得到的結(jié)果相印證。,外切糖苷酶的作用特點(diǎn)和底物專一性,糖鏈中糖基的連接順序分析，甲基化反應(yīng)過(guò)碘酸氧化和核磁共振等方法，結(jié)合糖苷酶的逐步水解方法，可提供順序的信息。采用核磁共振和紅外光譜法分析糖苷鍵的?-或?-異頭構(gòu)型。在不具備這些大型儀器的條件下，可采用糖苷酶水解的。,(2)打開(kāi)糖肽鍵獲得完整糖鏈,打開(kāi)O-型糖肽鍵常用的方法是采用稀堿水解(?-消除反應(yīng))的方法。打開(kāi)

38、N-型糖肽鍵主要采用肼解法?？刹捎锰擒彰阜椒ù蜷_(kāi)糖肽鍵，獲得天然的完整糖鏈。?-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶H(Endo-H)的應(yīng)用，在多甘露糖型N-型糖鏈的研究中，收到良好效果。,(3)獲得短糖鏈,有些植物或微生物來(lái)源的糖鏈，分子量大，并有重復(fù)的寡糖結(jié)構(gòu)單位，可以應(yīng)用合適的內(nèi)切糖苷酶，將長(zhǎng)的糖鏈打斷成為較短的寡糖片段，有利于結(jié)構(gòu)研究。,2、用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的外切糖苷酶,從肺炎雙球菌的培養(yǎng)液中純化得到?-半乳糖苷酶，可以水解Gal-?-1,

39、4GlcNAc糖苷鍵，但不能水解?-1,3和?-1,6鍵，表現(xiàn)出嚴(yán)格的對(duì)取代位置的專一性要求。?-半乳糖苷酶常用于N-型糖鏈的結(jié)構(gòu)分析，因?yàn)樵贜-型糖鏈中，Gal-G1cNAc之間的連鍵多為?-1,4。,用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的外切糖苷酶,?-半乳糖苷酶?-半乳糖苷酶?-甘露糖苷酶?-甘露糖苷酶?-巖藻糖苷酶?-N-乙酰己糖胺酶?-N-乙酰半乳糖胺酶唾液酸苷酶,?-半乳糖苷酶的底物專一性,?-巖藻糖苷酶的底物專一性,唾液酸苷酶

40、的底物專一性,?-半乳糖苷酶的底物專一性,3、用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)切糖苷酶,內(nèi)切糖苷酶主要體現(xiàn)在對(duì)糖基一側(cè)整個(gè)寡糖鏈的結(jié)構(gòu)有專一要求。它們作用于糖鏈的中間打斷糖苷鍵，水解產(chǎn)物為分子量小于原來(lái)底物的寡糖。,用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)切糖苷酶,?-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶?-N-乙酰半乳糖胺內(nèi)切酶?-半乳糖苷內(nèi)切酶?-1,6甘露聚糖內(nèi)切酶?-1,4氨基半乳糖苷內(nèi)切酶,幾種內(nèi)切糖苷酶的底物專一性,(1) ?-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶,按其來(lái)源和底

41、物專一性的差別，共分四種。(1)它們都能水解N-型糖中緊挨著天冬酰胺的兩個(gè)N-乙酰葡糖胺之間的?-1,4連接鍵。,(2)Endo-D和Endo-C1的底物專一性完全相同。 都要求在糖基一側(cè)有一個(gè)三碳結(jié)構(gòu)。非還原末端的?-甘露糖殘基必需沒(méi)有被其他糖取代。,?-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶,(3)indo-H的底物專一性，在糖基一例要求一個(gè)四糖結(jié)構(gòu): 非還原末端的?-甘露糖必需是，或者不被取代、或者是僅僅取代在C-2位置上。,卵清

42、蛋白糖肽的一條糖鏈,?-N-乙酰葡糖胺內(nèi)切酶,(4)Endo-C11的底物專一性，在糖基一側(cè)要求一個(gè)分枝的五糖單位，并且兩個(gè)處于還原末端的?-甘露糖殘基都必需、或者不被別的糖基取代，或者僅取代在C-2位置上。Endo-C11在糖苷配基一側(cè)的專一性要求，和Endo-H一樣，不容許有巖藻糖的取代。,(2) ?-N-乙酰半乳糖苷內(nèi)切酶,蛋白的O-型糖鏈中最常見(jiàn)的一種，是由糖鏈還原末端的N-乙酰半乳糖胺和糖鏈中的絲氨酸或蘇氨酸的羥基以?-0-

43、糖苷鍵連接而成。?-N-乙酰半乳糖胺內(nèi)切酶能夠切開(kāi)這個(gè)連鍵，把0-型糖鏈和肽鏈完全分開(kāi)。,(3) ? -半乳糖苷內(nèi)切酶,糖基一側(cè)必須是一個(gè)三糖單位，失去非還原末端的半乳糖-乙酰半乳糖胺，都不能成為該酶的底物。糖苷配基一側(cè)必須是N-乙酰葡糖胺或葡萄糖。被酶水解打開(kāi)的糖苷鍵必須是?-1,4連接。這個(gè)內(nèi)切酶只能用于帶有血型A(或B)決定簇的糖鏈，能作用于血型物質(zhì)H。,(4) 其他內(nèi)切糖苷酶,來(lái)自灰色鏈霉菌發(fā)酵液的一個(gè)氨基半乳糖苷內(nèi)切酶，

44、可以水解?-氨基半乳糖苷鍵。用于一種真菌所產(chǎn)生的氨基半乳聚糖的結(jié)構(gòu)研究。來(lái)自一株土壤芽孢桿菌的?-1,6甘露聚糖酶，能水解無(wú)側(cè)鏈取代的?-1,6甘露糖糖苷鍵，在研究酵母胞壁外層甘露聚糖結(jié)構(gòu)時(shí)，將大分子甘露聚糖外側(cè)鏈打斷，獲得靠近天冬酰胺結(jié)合位置的內(nèi)核結(jié)構(gòu)。,4、應(yīng)用中的問(wèn)題,在應(yīng)用糖苷酶進(jìn)行糖鏈結(jié)構(gòu)研究時(shí)，所取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)對(duì)照其他技術(shù)方法提供的信息，小心加以解釋，以免引出錯(cuò)誤的結(jié)論。影響糖苷酶測(cè)定結(jié)果的因素很多，大致有以下幾個(gè)方

45、面：,(1) 工具酶的選擇,任何一助糖苷酶都可用于糖鏈結(jié)構(gòu)研究的工具酶。一般應(yīng)選擇文獻(xiàn)中常用的，底物專一性清楚的糖苷酶作為工具酶。一種新分離純化的糖苷酶，應(yīng)該用各種常見(jiàn)的糖苷鍵結(jié)構(gòu)類型作底物，做一系列酶活性測(cè)定，確定其底物專一性，然后才能用做工具酶。,(2) 工具酶的純度,所采用的工具酶不應(yīng)混雜有別的酶。如果有少量蛋白酶沒(méi)有除盡，則可能在酶反應(yīng)中將所用的工具酶水解掉，使糖鏈水解過(guò)程中斷，并使產(chǎn)物中混入不應(yīng)有的雜質(zhì)，結(jié)果分析帶來(lái)困難

46、。如果有少量別種的糖敢酶摻雜在工具酶中，有可能帶來(lái)錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,(3) 遮蔽效應(yīng),按照其他技術(shù)方法得到的信息，選擇了一個(gè)合適的糖苷酶，可得不到預(yù)期的結(jié)果?？赡苁穷A(yù)先得到的信息有錯(cuò)誤?？赡苁橇硪粋€(gè)原因，底物結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，造成了分子的空間遮蔽效應(yīng)。,(4) 其他方面,在應(yīng)用糖苷酶于糖鏈結(jié)構(gòu)分析，遇到意料之外的負(fù)結(jié)果時(shí)，應(yīng)考慮以下幾種情況。(1)底物是否充分溶解了?有的樣品在水溶液中溶解不好，尤其是糖脂和膜結(jié)合糖蛋會(huì)極大地影響糖

47、苷酶的水解效果。適當(dāng)?shù)丶尤肴ノ奂】稍鰪?qiáng)糖昔酶對(duì)糖脂的水解。,其他方面,(2)是否有抑制劑存在?在復(fù)雜的無(wú)細(xì)胞制劑系統(tǒng)中，抑制劑存在的可能性更大。要考慮底物抑制或單糖抑制的可能性。(3)是否遇到了不常見(jiàn)的呋喃糖環(huán)?因?yàn)榻^大多數(shù)工具糖苷酶，是專一于吡喃環(huán)形式的。,?-L-巖藻糖苷酶測(cè)定的臨床應(yīng)用,?-L-巖藻糖苷酶是一種溶酶體酸性水解酶。以往主要用于遺傳性AFU缺乏引起的巖藻糖貯積病的診斷。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，?-L-巖藻糖苷酶測(cè)定對(duì)

48、肝癌的診斷具有較高的敏感性和特異性。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有利于肝癌的早期診斷、鑒別診斷, 并可作為轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的指標(biāo)，也可用于白血病及卵巢癌的診斷。,,葡萄糖苷酶可以使白葡萄酒的香氣提高,葡萄酒的香氣和味道是受聯(lián)結(jié)在一起的非易失性的化合物影響的，它可以被葡萄糖苷酶所損壞。,內(nèi)切木聚糖酶與木糖苷酶預(yù)處理對(duì)麥草漿漂白性能的影響,結(jié)果表明，無(wú)論是內(nèi)切木聚糖酶還是木糖苷酶預(yù)處理漂白漿的白度均比對(duì)照漿高，分別高出對(duì)照漿的2. 5 和1. 9 個(gè)百分點(diǎn)，同時(shí)

49、漂白漿的強(qiáng)度也好于對(duì)照漿的強(qiáng)度。內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶混合預(yù)處理漂白漿的白度分別比內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶高出0. 9 和1. 5 個(gè)百分點(diǎn)，這表明內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶在紙漿預(yù)處理過(guò)程中具有協(xié)同作用。,血漿殼三糖苷酶活性與冠狀動(dòng)脈病變密切相關(guān),對(duì)126例冠狀動(dòng)脈造影術(shù)患者按冠狀動(dòng)脈狹窄程度分組，將狹窄程度< 50%者列為對(duì)照組，≥50%者列為病變組，比較各組血清殼三糖苷酶及血脂等指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病變組血清殼三糖