一種催化多重位點糖苷化的茶樹類黃銅糖基轉(zhuǎn)移酶的鑒定.pdf

1、糖苷化的類黃酮衍生物，不僅僅是決定茶飲料澀味品質(zhì)的主要成分，也與茶樹的抗性特征相關(guān)。
　　本論文從茶樹中克隆出一條受到與植物抗性脅迫相關(guān)的類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因；實驗發(fā)現(xiàn)，原核表達的融合蛋白對多種底物包括柚皮素，芹菜素，槲皮素，山奈素，楊梅素，山奈酚和山奈酚單糖苷均檢測到活性；這種糖苷化反應可以發(fā)生在黃酮醇的3-OH、7-OH等多重位點上。超表達煙草葉片中也檢測到多個黃酮醇糖苷產(chǎn)物積累的增加。
　　本論文主要研究結(jié)果如下：

2、r>　　1．以茶鮮葉cDNA為模板，利用RACE技術(shù)獲得了一條類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA全長；其cDNA全長為1789bp，包括3'端非編碼序列（236 bp），5'端非編碼序列（128bp），開放閱讀框（1428 bp）；它編碼了475個氨基酸殘基，預測蛋白的分子量為53.72kDa，等電點為5.62。信號肽分析表明該基因不含有信號肽。進化樹分析將該基因歸類于 ClusterⅢa組，預測可能克隆了一條7-OH糖基化類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶

3、。同源建模結(jié)果表明，該蛋白與 VVGT1晶體結(jié)構(gòu)的一致性為31％，分子對接表明，CsUGT73A20可以同時進行3,7糖苷化。該基因提交給UGTs命名委員會，并被命名為CsUGT73A20。
　　2.構(gòu)建了pMD19-T和pMAL-C2X重組質(zhì)粒，將CsUGT73A20開放閱讀框轉(zhuǎn)化到表達菌株Novablue中。誘導表達后，對融合蛋白進行了洗脫分離，得到純化后的蛋白。利用HPLC及UPLC-MS檢測技術(shù)，對重組蛋白的酶活產(chǎn)物進行鑒

4、定，結(jié)果表明黃烷酮（柚皮素），黃酮（芹菜素）和黃酮醇（山奈酚，槲皮素，楊梅素、山奈素）及黃酮醇苷（山奈酚3-O-葡萄糖苷和山奈酚7-O-葡萄糖苷）均是它的底物；對于多羥基的黃酮醇底物而言，可以檢測到多重產(chǎn)物，推測糖苷化反應還可以發(fā)生在黃酮醇的多位點羥基上。
　　3．酶動力學實驗表明，在35℃，pH8條件下，柚皮素（N）、芹菜素（A）、山奈酚（K）、槲皮素（Q）、山奈酚3-O-葡萄糖糖苷（K3G）、山奈酚7-O-葡萄糖糖苷（K7G）

5、和山奈素（KC）底物的KM分別為13.6μM、18.2μM、4.9μM、37.7μM、27.5μM、13.1μM和19.0μM,表明山奈酚可能是體內(nèi)最適底物。實驗還發(fā)現(xiàn)，當以山奈酚為底物時，多羥基糖苷化產(chǎn)物受到反應pH值的影響，在pH為8.0條件下，3-O-7-O-葡萄糖糖苷產(chǎn)物含量最高，而在pH9.0時則3-O-葡萄糖糖苷產(chǎn)物最高。但是KM值檢測表明，無論是pH為8.0還是9.0條件下，山奈酚7-O-葡萄糖底物的KM值均小于3-O-山