一株α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌的選育、鑒定、產(chǎn)酶條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、環(huán)糊精(cyclodextrin，縮寫CD)是由α-1,4-糖苷鍵相連而成的，環(huán)狀的，無還原端的麥芽低聚糖。環(huán)糊精通常由6、7或8個(gè)葡萄糖殘基組成，分別被稱為α-、β-、或γ-環(huán)糊精。除了這三種常用的環(huán)糊精外，還有δ-、ε-、ζ-和η-環(huán)糊精（分別由9~12個(gè)葡萄糖單元組成）。環(huán)糊精具有能夠?qū)⒍喾N化學(xué)物質(zhì)全部或部分封裝入空腔內(nèi)的能力，從而改變了這些化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)。這一特性使環(huán)糊精在醫(yī)藥、食品、化工、化妝品、工業(yè)和農(nóng)業(yè)以及分析化學(xué)

2、等方面得到廣泛的應(yīng)用。目前環(huán)糊精的制備主要是采用酶法合成的，化學(xué)合成法并不常用，而酶法制備會(huì)產(chǎn)生多種環(huán)糊精的混合物，不利于單一環(huán)糊精的分離純化，這極大限制了環(huán)糊精的應(yīng)用。因此，尋求一種能夠催化生成特定環(huán)糊精的CGTase的生產(chǎn)菌，成為降低環(huán)糊精分離純化成本所關(guān)注的焦點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過菌株的篩選和選育得到一株產(chǎn)α-CGTase的誘變菌株Y112；以單因素法結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件；同時(shí)對(duì)α-CGTase進(jìn)行純化，并研究

3、其酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果分述如下：
　　菌株的分離篩選及鑒定：用活性平板法進(jìn)行菌種篩選，對(duì)其中透明圈與菌株直徑之比較高者進(jìn)行搖瓶復(fù)篩測(cè)酶活，其中以代號(hào)112菌株活力最高。采用亞硝基胍和利福平復(fù)合誘變的方法對(duì)菌株112進(jìn)行誘變，選取致死率95％的劑量，再經(jīng)過初篩復(fù)篩得到遺傳穩(wěn)定的誘變株 Y112，其產(chǎn)酶能力較出發(fā)菌株提高了37%。通過形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)以及16S rDNA的序列對(duì)比進(jìn)行產(chǎn)酶菌鑒定，初步鑒定為芽孢桿菌。
　　菌株產(chǎn)酶條

4、件優(yōu)化：通過單因素篩選對(duì)菌株產(chǎn)酶的培養(yǎng)基成分(碳源、氮源、金屬離子、磷酸鹽、鹽度、pH)和培養(yǎng)條件（裝液量、接種量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)，挑選出對(duì)菌株產(chǎn)酶影響較大的八個(gè)因素，先用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出3個(gè)主要影響因素(蛋白胨、酵母浸粉、溫度)，然后采用中心組合法對(duì)這三個(gè)主要因素進(jìn)行優(yōu)化。最終根據(jù)單因素和響應(yīng)面法得出菌株Y112的最佳培養(yǎng)基成分為：玉米淀粉7.5g/L，蛋白胨17.8 g/L

5、，酵母浸粉9.1g/L，Mn2+0.6 mmol/L，NaCl50 g/L，Na2CO315 g/L(pH9.6)。最佳產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件為：250 mL三角瓶裝液25mL，接種量為4%，27℃、230 r/min發(fā)酵培養(yǎng)50 h。菌株產(chǎn)酶條件經(jīng)過優(yōu)化后，酶活提高為原來的2.8倍。
　　酶的純化：發(fā)酵制備的α-CGTase粗酶液，經(jīng)過三步純化獲得電泳純酶樣品：首先篩選出最佳的乙醇分級(jí)沉淀?xiàng)l件；然后選取對(duì)α-CGTase酶穩(wěn)定性無影響的

6、緩沖體系，將乙醇分級(jí)沉淀后的樣品進(jìn)行Superdex200分子篩層析和DEAE-Sepharose離子交換層析純化，最終酶的純度提高了12.4倍，酶活回收率為57.5%。最終純化的樣品在聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上顯示為一條帶，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對(duì)數(shù)(logMr)與遷移率(Rf)作圖，得到回歸方程，然后帶入目的蛋白遷移率求得測(cè)定其分子量為90 kDa。
　　酶學(xué)性質(zhì)：菌株Y112所產(chǎn)α-CGTase的最適pH為8.5，

7、最適反應(yīng)溫度為55℃；在pH7.0-9.0和45℃以下穩(wěn)定；Ag2+會(huì)使酶完全失活，Ba2+、Li+、Cu2+、Hg2+、Al3+、吐溫20、CTAB、DMSO對(duì)酶活影響不大，Mn2+、Mg2+對(duì)酶活性有一定的促進(jìn)作用；而Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、EDTA、SDS在一定程度對(duì)酶活有抑制作用；根據(jù)Hanes-Woolf作圖法，以[S]/v對(duì)[S]作圖，根據(jù)回歸方程可以求得該酶以可溶性淀粉為底物的米氏常數(shù)Km為5.5