桑樹類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的鑒定及功能分析.pdf

1、桑樹（Morus alba L.）是一種多年生雙子葉木本植物。桑葉是家蠶最佳的天然食源；桑椹是桑樹的果實，味道甘甜可口，果肉多汁，營養(yǎng)豐富，作為一種新型的綠色水果備受人們的青睞。桑樹具有很多廣泛用途，包含營養(yǎng)保健、中醫(yī)資源及生態(tài)保護等。類黃酮（Flavonoids）是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，常以結(jié)合態(tài)或自由態(tài)形式存在于許多食源性植物中。槲皮素（Quercetin）是最典型的類黃酮化合物。類黃酮3–O–葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）是催化

2、糖基從尿苷–5′–二磷酸二鈉鹽（UDP）–葡萄糖轉(zhuǎn)移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷的一類轉(zhuǎn)移酶基因，研究該基因的表達(dá)和功能，對了解植物類黃酮的合成和積累機制具有重要意義。在前期的研究中，已從桑樹中克隆并鑒定了花青素生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因，并進行了信息學(xué)分析，但沒有分析桑樹MaUFGT基因的功能。本研究以多年保存的果桑種質(zhì)資源‘嘉陵40號’的組織為材料，采用分子生物學(xué)等研究方法，研究該基因在花青素生物合成途徑中的功能。為果桑新品

3、種選育及利用基因工程方法調(diào)控桑椹花青素的生物合成奠定基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用qRT-PCR技術(shù)研究了MaUFGT基因在桑樹各組織和發(fā)育期的表達(dá)水平。結(jié)果表明：隨著果實發(fā)育成熟，MaUFGT1、MaUFGT2和 MaUFGT3的表達(dá)模式相似，均呈上升趨勢；在從頂芽依次向下的不同葉位中，3個UFGT基因的表達(dá)呈現(xiàn)先降低后升高，再降低又升高的趨勢；在幼莖皮層和托葉中大量表達(dá)，幼莖表皮和木質(zhì)部、葉柄中表達(dá)量較低，有的甚至不表

4、達(dá)。MaUFGT2的表達(dá)量在3個基因中都是最高的，推測MaUFGT2基因是該基因家族的主效基因。⑵通過生物信息學(xué)方法，從川?；蚪M數(shù)據(jù)庫中鑒定出3個UFGT基因，并對其進行生物信息學(xué)分析。另外，從果桑品種‘嘉陵40號’的成熟果實中克隆了主效基因UFGT2，命名為MaUFGT2，登錄號 KP455729.1。其cDNA全長為1386 bp，編碼461個氨基酸，推測蛋白質(zhì)分子量約為51 kDa，理論等電點為7.77。序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)所編碼的

5、蛋白在不同物種間保守性不高。⑶將MaUFGT2基因連接到pET-28a(+)表達(dá)載體中，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達(dá)，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，表達(dá)蛋白大小約為52 kDa，主要以包涵體形式存在，在上清液中也有少量表達(dá)。采用超聲波破碎方法裂解細(xì)胞，然后用8mol/L尿素溶解表達(dá)產(chǎn)物，通過Ni-NTA柱對破碎的包涵體溶液中的表達(dá)蛋白進行分離純化，收集融合蛋白，純化后的目