柚檸檬苦素葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、表達(dá)及植物表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、檸檬苦素類似物是引起柑橘苦味的主要原因之一,柑橘的苦味對(duì)柑橘果實(shí)的鮮食和加工品質(zhì)有明顯不利影響。此外,檸檬苦素類似物具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、昆蟲(chóng)拒食等很多藥理活性。由于檸檬苦素類似物具有這些功能,所以檸檬苦素類似物的需求日益增加,但是苦味的存在限制了人們對(duì)它的攝取。檸檬苦素類似物配糖體具有水溶性且無(wú)苦味等特性,其生物學(xué)活性和檸檬苦素類似物是相似的。因而將其作為替代性食品添加劑,有很好的市場(chǎng)前景。
　　 本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,

2、從梁平柚中擴(kuò)增出了一個(gè)檸檬苦素類似物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因CmLGT。先后構(gòu)建了CmLGT基因的原核表達(dá)載體和植物表達(dá)載體,研究的主要結(jié)果如下:1.檸檬苦素類似物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因CmLGT的擴(kuò)增及編碼蛋白性質(zhì)分析。
　　 根據(jù)GenBank公布的檸檬苦素類似物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(LGT)基因的核苷酸序列,設(shè)計(jì)并合成特異性引物。以梁平柚成年樹(shù)幼葉總RNA為模板,通過(guò)PCR方法擴(kuò)增到檸檬苦素類似物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的全長(zhǎng)編碼區(qū),并通過(guò)生物

3、信息學(xué)方法對(duì)CmLGT基因編碼蛋白的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示:它編碼511個(gè)氨基酸,分子量約為57.467KD,等電點(diǎn)為6.01,有21個(gè)磷酸化位點(diǎn),沒(méi)有信號(hào)肽。CmLGT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋(helix,28.18％),延伸鏈(extended strand,22.11％),隨機(jī)卷曲(random coil,49.71％)組成。在NCBI上對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)CmLGT基因編碼的蛋白具有GT家族的特征。
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4、.CmLGT基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)體系的優(yōu)化。
　　 將目的基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中,構(gòu)建了該基因的融合表達(dá)載體pET28a-CmLGT,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)最優(yōu)條件(4 h,37℃和1.0mmol·L-1IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)獲得大小約為62kD的目的融合蛋白,對(duì)融合蛋白進(jìn)行可溶性分析發(fā)現(xiàn)該融合蛋白以包涵體形式存在。
　　 3.植物表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　 通過(guò)雙酶切、連

5、接、轉(zhuǎn)化等過(guò)程將目的基因CmLGT連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA2301g中,轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404,利用BamHI和SacI雙酶切及PCR驗(yàn)證,表明成功構(gòu)建了目的基因的植物表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。
　　 4.對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。
　　 應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將含有檸檬苦素類似物葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因CmLGT的植物表達(dá)載體導(dǎo)入野生煙草植株中,通過(guò)抗性篩選、GUS組織化學(xué)染色以及PCR擴(kuò)增檢測(cè),獲得轉(zhuǎn)基