梁平柚鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因Cm1,2RhaT的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、柚Citrusgrandis(L.)Osbeck又名拋、文旦等,是蕓香科(Rutaceae)柑桔屬(Citrus)植物。已證實(shí)柑橘苦味來自兩方面的作用,黃酮類化合物中的柚皮苷和檸檬苦素類化合物。柚皮苷、檸檬苦素在柚果實(shí)中均有較高的含量[1],柚皮苷是柚中主要的黃烷酮,具有降低血漿中總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇(動(dòng)脈粥樣硬化的主要致病因素)水平的作用[2]。在食品工業(yè)上,柚皮苷既可作為天然色素、風(fēng)味改良劑和苦味劑用于食品、飲料的生產(chǎn),又可

2、作為合成高甜度、無毒、低能量的新型甜味劑二氫柚苷查爾酮和新橙皮苷查爾酮的原料[3]。柚皮苷的應(yīng)用將越來越廣泛。在植物次生代謝物合成途徑中關(guān)鍵酶的分離及其基因的克隆是植物次生代謝酶促反應(yīng)機(jī)制研究的基礎(chǔ),而特定植物次生代謝物合成與積累量取決于其合成途徑中的限速酶,它們在植物次生代謝物生物合成途徑中往往位于代謝支路分叉口或途徑的下游[4]。鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶作為柑橘中最主要的苦味物質(zhì)柚皮苷合成過程中的關(guān)鍵酶近年來受到廣泛的關(guān)注。
　　 本

3、研究在前人研究的基礎(chǔ)上,從梁平柚中擴(kuò)增出了一個(gè)鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因Cm1,2RhaT。構(gòu)建了Cm1,2RhaT基因的原核表達(dá)載體,研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因Cm1,2RhaT的擴(kuò)增及編碼蛋白性質(zhì)分析
　　 根據(jù)GenBank公布的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶(RhaT)基因的cDNA序列,設(shè)計(jì)并合成特異性引物。以梁平柚成年樹幼葉為材料,通過PCR和RT-PCR方法擴(kuò)增到鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶(RhaT)基因Cm1,2Rh

4、aT的DNA序列和cDNA序列(GenBank登錄號(hào)為:JQ217381)。cDNA長1436bp,推測的編碼蛋白Cm1,2RhaT包含453個(gè)氨基酸,理論分子量為51.2kd。進(jìn)一步分析可知其有14個(gè)磷酸化位點(diǎn),沒有信號(hào)肽。Cm1,2RhaT蛋白二級結(jié)構(gòu)由α螺旋(helix,42.04%),延伸鏈(extendedstrand,16.15%),隨機(jī)卷曲(randomcoil,41.81%)組成。在NCBI上對其保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)Cm1

5、,2RhaT基因編碼的蛋白質(zhì)屬于Glycosyltransferase_GTB_type超家族。
　　 2.Cm1,2RhaT基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)體系的優(yōu)化
　　 將Cm1,2Rha瑾因克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)中,構(gòu)建了該基因的融合表達(dá)載體pET28a-CmRhaT,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)最優(yōu)條件(4h,37℃和1.0mmol·L-1IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)獲得大小約為56kD的目的融合蛋白

6、,對融合蛋白進(jìn)行可溶性分析發(fā)現(xiàn)該融合蛋白以包涵體形式存在。
　　 3.Cm1,2RhaT蛋白質(zhì)的分離純化、復(fù)性與活性檢測
　　 重組蛋白以包涵體的形式存在,以6M的尿素溶解包涵體,按Merck公司的蛋白純化系統(tǒng)操作指南進(jìn)行分離純化并稍做改進(jìn),通過透析復(fù)性,分離純化得到了較高濃度0.526mg.ml-1和純度為95%的融合蛋白。利用柚果皮和葉片中的天然物質(zhì)測定酶活性,得到的數(shù)據(jù)不能夠計(jì)算出酶活力,但能看出葉片中的柚皮苷含量

7、比果實(shí)中的高。
　　 4.Cm1,2RhaT基因表達(dá)分析
　　 利用SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測梁平柚的Cm1,2RhaT基因以及其它4種柑橘品種溫州蜜柑(Citusreticulatecv.Unshiu),、費(fèi)米耐勞(CitruslimonL.BumF.Femminello)、沙田柚(Citusmaximacv.Shatian)、血橙(Citrussinensiscv.(L.)Xuecheng)的同源基因