α-1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因新突變位點(diǎn)與功能關(guān)系的研究.pdf

1、H抗原與ABO血型、Lewis血型密切相關(guān),屬于Hh血型系統(tǒng).Hh血型系統(tǒng)存在孟買型和類孟買型兩種罕見(jiàn)表型,表現(xiàn)為紅細(xì)胞上完全或部分缺失H抗原.紅細(xì)胞上H抗原受控于Q.1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Q 1,2-fucosyltransfcrase gene,FUTl),已證實(shí)FUTl突變可導(dǎo)致孟買型和類孟買型.本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中通過(guò)對(duì)FUTl基因編碼序列分析,發(fā)現(xiàn)類孟買型的一個(gè)新突變類型(682A>G+35C>T),該復(fù)合突變分別導(dǎo)致A1

2、2V和M228V氨基酸替換.國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)者認(rèn)為35C>T是引起類孟買型的突變點(diǎn)(命名為h4),但我們通過(guò)人群頻率調(diào)查和15種哺乳動(dòng)物同源的FUTl糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列比對(duì),認(rèn)為35C>T.是多態(tài)性位點(diǎn),應(yīng)與FUTl酶活性和類孟買型無(wú)關(guān),推測(cè)應(yīng)是682A>G突變引起H抗原減弱.本研究目的旨在從體外實(shí)驗(yàn)明確該新突變類型(682A>G+35C>T)的機(jī)制,從蛋白質(zhì)和mRNA水平對(duì)35C>T,682A>G突變和α-1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶功能的關(guān)系

3、進(jìn)行研究,以解決35C>T和682A>G在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)H抗原表達(dá)的影響. 方法： 1.類孟買型先證者采用血清學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定,實(shí)驗(yàn)以類孟買型先證者基因組DNA為研究對(duì)象,經(jīng)PCR擴(kuò)增FUTl全長(zhǎng)編碼序列后割膠回收純化.通過(guò)TOPO TA克隆將目的DNA片段連接至表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His,克隆篩選后獲取重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序分析,以獲取包含有目的基因片段的重組質(zhì)粒,包括35T、682G+35T和正常對(duì)照

4、682A+35C的重組質(zhì)粒. 2. 按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法在培養(yǎng)板上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞COS-7細(xì)胞株,將重組質(zhì)粒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法分別轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期COS-7細(xì)胞. 3.轉(zhuǎn)染后COS-7細(xì)胞經(jīng)G418篩選,采用直接免疫熒光染色的方法于第2天、第3天、第4天、第7天流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面H抗原的表達(dá)情況. 4.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染第1天,第2天,第3天的細(xì)胞檢測(cè)mRNA水平FUTl的表達(dá)情況,以G6PD

5、為內(nèi)參基因,FUT1為目的基因,分別選用標(biāo)準(zhǔn)PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒純品作為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣本進(jìn)行定量比較. 結(jié)果： 1.獲取目的基因重組質(zhì)粒以先證者或正常對(duì)照基因組DNA為模板,FIJTlF和FUTlR引物對(duì)擴(kuò)增FUTl基因,2﹪瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示可見(jiàn)分子量為1094bp的特異性條帶,將其割膠回收片段TOPO TA.克隆,提取質(zhì)粒測(cè)序分析結(jié)果,分別獲取35T、682G+35T和正常對(duì)照682A+35C的重組質(zhì)粒.

6、 2.轉(zhuǎn)染后抗原分析通過(guò)FITC標(biāo)記的抗H抗體對(duì)轉(zhuǎn)染后COS-7細(xì)胞表面的H抗原進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞不表達(dá)H抗原,第2天后H抗原分別在35T、682G+35T和682A+35C三種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞膜上表達(dá),表達(dá)量隨著時(shí)間呈現(xiàn)先遞增后下降的趨勢(shì),在第4天達(dá)最大值.與野生型(682A+35C)重組質(zhì)粒相比,(682G+35T)質(zhì)粒H抗原的表達(dá)量?jī)H為野生型的13.3﹪,而35T.為野生型的52.7﹪.

7、 3.轉(zhuǎn)染后mRNA分析我們通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品繪制雙標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對(duì)轉(zhuǎn)染第1天、第2天、第3天的COS-7細(xì)胞胞內(nèi)FUTl目的基因與G6PD內(nèi)參基因進(jìn)行了定量分析和比較.結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后FUTl mRNA水平隨著時(shí)間變化呈遞減,在第l天(682G+35T)FUTl mRNA水平僅為(682A+35C)的40﹪. 結(jié)論：1.實(shí)驗(yàn)成功獲得了FUTl重組表達(dá)質(zhì)粒,構(gòu)建了FUTl體外瞬時(shí)表達(dá)體系,體外從蛋白質(zhì)水平證實(shí)類孟買型H抗原呈弱表達(dá)的特點(diǎn)