巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在肺腺癌中的臨床意義及功能研究.pdf

1、目的：
　　蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的翻譯后修飾，并對(duì)蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)有重要的影響。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族在多種腫瘤中表達(dá)異常，但其在肺癌中的表達(dá)情況及其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)在前期收集臨床組織標(biāo)本的基礎(chǔ)上，篩選肺癌組織中特異表達(dá)的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，并構(gòu)建FUT2低表達(dá)肺腺癌A549細(xì)胞株，觀察FUT2的表達(dá)變化對(duì)A549細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，為肺腺癌檢測(cè)診斷及其分子靶向治療提供新的方法和理論依據(jù)。
　　方法：
　　第一部

2、分:
　　(1)Trizol法提取了肺癌新鮮配對(duì)組織的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（SYBR Green法）分別檢測(cè)FUT2(22例)/FUT4(10例)/FUT7(19例)/FUT8（16例）的mRNA在癌組織和鄰近正常組織中的表達(dá)。
　　(2)用Western Blot分析肺癌新鮮配對(duì)組織中FUT2/FUT8蛋白表達(dá)水平。用Image J軟件對(duì)目的蛋白FUT2（21例）/FUT8（13例）及內(nèi)參Tu

3、bulin/GAPDH蛋白進(jìn)行相對(duì)定量，分析FUT2/FUT8蛋白的表達(dá)情況。
　　(3)用HE染色法對(duì)收集到的4對(duì)肺腺癌配對(duì)組織切片進(jìn)行染色，確定標(biāo)本的正確性;并采用SABC免疫組化法檢測(cè)FUT2/FUT8的蛋白表達(dá)情況。
　　第二部分:
　　(1)把FUT2的RNA干擾質(zhì)粒載體和對(duì)照無(wú)義序列載體用脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞株，并采用G418抗生素篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞單克隆。
　　(2)分別采用實(shí)時(shí)熒光定

4、量PCR（SYBR Green法）檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)、Western Blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，衡量FUT2 shRNA干擾效果。
　　(3)CCK-8法檢測(cè)FUT2干擾后對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（SYBR Green法）檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1基因水平表達(dá)情況。
　　(4)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法檢測(cè)FUT2對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。
　　(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（SYB

5、R Green法）和Westem Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)粘附因子E-cadherin、β-catenin的基因和蛋白水平表達(dá)情況，并運(yùn)用免疫熒光技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡下觀察β-catenin蛋白在FUT2穩(wěn)定干擾A549細(xì)胞內(nèi)的分布情況。
　　(6)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP2/MMP9的蛋白表達(dá)的變化。
　　(7)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(SYBR Green法)和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡

6、因子BCL-2基因和蛋白水平表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.在肺癌標(biāo)本中，F(xiàn)UT7 mRNA在癌組織表達(dá)有所降低，F(xiàn)UT8 mRNA表達(dá)有所升高。在肺腺癌標(biāo)本中，F(xiàn)UT2/FUT8 mRNA呈高表達(dá)趨勢(shì);
　　2.在肺癌標(biāo)本、肺腺癌標(biāo)本中FUT2/FUT8蛋白水平都呈高表達(dá)趨勢(shì);
　　3.經(jīng)HE染色確診的肺腺癌組織標(biāo)本切片中FUT2/FUT8蛋白水平都呈高表達(dá)趨勢(shì);
　　4.FUT2干擾質(zhì)粒載體已成功轉(zhuǎn)入肺

7、腺癌A549細(xì)胞并得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株;
　　5.FUT2干擾后能抑制A549細(xì)胞的增殖能力，CyclinD1 mRNA表達(dá)降低;
　　6.FUT2低表達(dá)細(xì)胞遷移能力有所降低;
　　7.FUT2低表達(dá)細(xì)胞中E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào);β-catenin mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，其總蛋白水平無(wú)明顯趨勢(shì);β-catenin在肺腺癌A549細(xì)胞膜上積聚，表達(dá)量有所升高;
　　8.基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP

8、2/MMP9的蛋白水平表達(dá)降低;
　　9.FUT2干擾后抗凋亡因子BCL-2基因水平明顯下調(diào)，而蛋白水平有所降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　本研究通過(guò)臨床組織標(biāo)本中特異性巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的篩選，發(fā)現(xiàn)FUT2/FUT8在肺癌及肺腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì);同時(shí)成功構(gòu)建FUT2靶向干擾肺腺癌A549細(xì)胞株的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染模型。綜合所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明，下調(diào)FUT2的表達(dá)，肺腺癌A549細(xì)胞的無(wú)限增殖和遷移侵襲能力受到抑制，并對(duì)細(xì)胞