家蠶幾種尿苷二磷酸-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)與功能研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)天然有色蠶繭分為紅黃繭系和黃綠繭系兩大類(lèi)。決定黃紅繭系繭色的色素主要來(lái)自桑葉中的胡蘿卜素(β-胡蘿卜素、新生β-胡蘿卜素等)和葉黃素類(lèi)色素(葉黃素、蒲公英黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、次黃嘌呤黃質(zhì)等),而黃綠繭系的色素主要為黃酮類(lèi)化合物。家蠶從桑葉中攝入的黃酮類(lèi)化合物,需要在體內(nèi)進(jìn)行化學(xué)修飾之后方能顯現(xiàn)出綠繭色,但綠繭色的形成以及黃酮類(lèi)色素的化學(xué)修飾分子機(jī)理,特別是基因調(diào)控機(jī)理目前還不清楚。
　　 尿苷二磷酸.葡萄

2、糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)是一群廣泛分布于動(dòng)物、植物、細(xì)菌以及病毒,與糖基化有關(guān)的蛋白酶超家族。該類(lèi)酶催化核苷酸的糖基轉(zhuǎn)移到受體分子的糖苷配基上,從而使受體分子從疏水性轉(zhuǎn)變成親水性。昆蟲(chóng)利用UGT酶的糖基化作用降解食物中的有毒植物化學(xué)物質(zhì),以抵抗食物有毒成分對(duì)機(jī)體造成的危害,UGT酶甚至還與殺蟲(chóng)劑的抗藥性有關(guān)。
　　 家蠶等昆蟲(chóng)從植物攝取的黃酮類(lèi)化合物在體內(nèi)需要經(jīng)過(guò)一系列如UGT酶參與的糖基化作用等化學(xué)修飾,而家蠶繭層中的黃酮類(lèi)化合

3、物分子結(jié)構(gòu)也與桑葉中的黃酮類(lèi)化合物明顯不同,家蠶從桑葉攝取的一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物槲皮素,先在中腸生成5.氧糖苷槲皮素,后在絲腺生成4’5’-雙氧糖苷槲皮素。已知家蠶綠色繭的繭色形成主要由黃酮化合物的含量所決定,可以推測(cè),UGT酶的基因家族可能與黃酮類(lèi)色素在家蠶體內(nèi)的轉(zhuǎn)移,以及蠶繭的成色有關(guān)。
　　 家蠶是鱗翅目模式生物,其天然有色繭是具有重大應(yīng)用前景的遺傳資源。由于家蠶繭色受多基因調(diào)控,遺傳機(jī)制了解不詳,挖掘和研究繭色調(diào)控基因是被公

4、認(rèn)的有效突破口之一。本文依靠家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)資源,利用分子克隆、RACE、RNAi、bac-to-bac昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)等技術(shù)手段,對(duì)鱗翅目模式昆蟲(chóng)家蠶的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)模式和功能進(jìn)行了研究,希望進(jìn)一步揭示UGT基因的功能,以及家蠶繭色的形成機(jī)理,為繭色分子標(biāo)記和分子設(shè)計(jì)育種提供幫助,主要結(jié)果如下:
　　 1.首次在家蠶中克隆出4種尚未克隆的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因,包括UGT013830(UGT30)、UGT013834(UGT

5、34)、UGTO13859(UGT59)、UGT013860(UGT60)基因。利用RACE技術(shù)成功的克隆出UGT30基因的全長(zhǎng)cDNA,其長(zhǎng)度為2136bp(登錄號(hào)為:HQ833816)。根據(jù)已有報(bào)道,選取了7種在中腸和絲腺中表達(dá)量較高的UGT基因,包括UGT30、UGT34、UGT59、UGT60、UGT013865(UGT65)、UGT010286(UGT86)和UGT010289(UGT89),對(duì)其中一些基因做了時(shí)空表達(dá)的調(diào)查。

6、
　　 2.為了研究UGT酶對(duì)家蠶繭色的影響,用RT-PCR方法對(duì)以上7種基因在白繭品種C108和皓月、綠繭品種火造和G1、黃繭品種Y12和黃繭限性品種Ys的絲腺、中腸和生殖腺組織中的表達(dá)進(jìn)行了定性與定量分析。結(jié)果顯示,UGT30、UGT86和UGT89具有綠繭品種特異性表達(dá),可能與綠繭色形成有關(guān),而UGT30在不同繭色品種還存在mRNA轉(zhuǎn)錄本的差異。
　　 3.進(jìn)一步闡明這些UGT基因的作用,我們選取了UG730,具有

7、綠繭品種特異性表達(dá)的基因,以體外轉(zhuǎn)錄合成長(zhǎng)鏈dsRNA,并優(yōu)化了注射家蠶體內(nèi)的濃度。由于dsRNA注射的有效時(shí)間是36-72 h,我們采取在大造品種5齡期間共兩次注射5μg／dsRNA。家蠶在注射dsRNA UGT30后,出現(xiàn)死亡率增加、發(fā)育變緩?？赡苁怯捎诩倚Q發(fā)育過(guò)程中UGT30蛋白對(duì)于物質(zhì)在體內(nèi)代謝的起到重要的作用,UG730基因表達(dá)量下調(diào)將導(dǎo)致家蠶體質(zhì)變?nèi)?不能正常生長(zhǎng)。另外,檢測(cè)注射前后絲腺和中腸總黃酮含量,結(jié)果顯示總黃酮含量在

8、注射前后幾乎未發(fā)生改變。而后我們又采用Real time PCR方法,選取了UGT30和UGT86基因,對(duì)家蠶5齡幼蟲(chóng)不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平以及蛻皮激素和植物次生代謝物誘導(dǎo)下5齡幼蟲(chóng)不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了測(cè)定。
　　 4.以Bac-to-Bac桿狀病毒感染的Sf9昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)獲得了大量高活性UGT86和UGT30重組蛋白；將重組后的粘粒與陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合后轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,獲得重組桿狀病毒,感染Sf9細(xì)胞72h后收集蛋白,采用R