尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A(UGT1A)某些常見突變的臨床遺傳藥理學(xué)研究.pdf

1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)存在于大部分脊椎動物的肝微粒體中,是最重要的Ⅱ相代謝酶之一。但是由于其分布特點,活性部位位于微粒體的內(nèi)腔側(cè),而非像Ⅰ相微粒體酶CYP450一樣位于微粒體的胞漿側(cè),所以對其研究相對少。但隨著實驗技術(shù)的發(fā)展,對UGT的研究日益增多。
　　 UGT催化脂溶性物質(zhì)發(fā)生葡萄糖醛酸基結(jié)合反應(yīng),轉(zhuǎn)化為親水性物質(zhì)排出。UGT的底物廣泛,包括內(nèi)源性物質(zhì)如

2、膽紅素,類固醇激素,和外源性物質(zhì)如酚類毒物,NSAIDS類藥物及麥考酚酸等。大部分葡萄糖醛酸基結(jié)合產(chǎn)物是無毒無活性的,除嗎啡-6-0-葡萄糖醛酸基活性是母藥的50倍,而有羧酸基團的藥物(如雙氯芬酸,托美丁、阿司匹林和麥考酚酸)的葡萄糖醛酸化可產(chǎn)生毒性的?；a(chǎn)物,通過與細胞大分子產(chǎn)生加合產(chǎn)物而產(chǎn)生毒性。
　　 UGT1A是UGT家族中的重要亞家族,共包括9種蛋白。通過目前有限的種屬間的數(shù)據(jù),UGT1A功能在種屬間有很高的相似性,提

3、示UGT1A有非常重要的生理功能。人體內(nèi)UGT1A的代謝功能存在很大的個體差異、種族差異和年齡差異。越來越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)UGT1A是一個高度多態(tài)的酶,基因多態(tài)性是UGT1A功能差異的重要因為之一。
　　 UGT1A的基因結(jié)構(gòu)非常特殊,UGT1A家族的成員由位于2q37的一個跨度大于500kb的復(fù)雜基因簇所編碼。它們共用2—5外顯子,編碼UGT1A蛋白共同C末端(UDPGA結(jié)合域)。它們有各自的第1外顯子和啟動調(diào)控區(qū),編碼UGT1A

4、蛋白特異的N端(底物識別區(qū))。鑒于UGT1A的基因結(jié)構(gòu),共用C末端所以UGT1A的底物有重合性,但主要的底物識別區(qū)N末端是獨立的所以各個酶又有一定的底物特異性,只是親和力有所不同。如麥考酚酸主要由UGT1A9代謝為無活性的代謝產(chǎn)物,也有UGT1A7、UGT1A8和UGT1A10的參與；伊立體康的活性代謝產(chǎn)物SN-38主要由UGT1A1催化代謝清除,也有UGT1A9和UGT1A7的參與；對乙酰氨基酚主要由UGT1A6代謝為無活性代謝產(chǎn)物,

5、也有UGT1A1和UGT1A9的參與(通過本實驗證實,這個僅限于低劑量對乙酰氨基酚)。
　　 同時,UGT1A的表達存在組織特異性。在主要的藥物代謝器官:肝臟中有UGT1A1,UGT1A3,UGT1A4,UGT1A6和UGT1A9的表達,又以UGT1A9>UGT1A1>UGT1A6這三個酶最多。因此本研究主要關(guān)注此三個UGT1A家族的重要酶。
　　 UGT1A的多態(tài)性分布存在以下特點:在共用的2-5個外顯子上存在的突變,

6、可以導(dǎo)致多個酶活性異常,同時也屬于罕見突變。因此對UGT1A的突變研究更關(guān)注在其第一外顯子和啟動子區(qū)。又因為存在一定的底物重疊性,所以,對UGT1A突變的研究我們從參與代謝酶的單倍型著手。綜合考慮多個代謝酶多個突變對其代謝的影響,可以更好的解釋主要通過葡萄糖醛酸化代謝藥物的個體差異。
　　 對乙酰氨基酚(APAP)是苯胺類非甾體抗炎藥,通過抑制前列腺素(PG)的合成而發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛消炎作用。APAP過量可導(dǎo)致急性中央小葉性肝壞死,

7、為致死性藥物毒性。APAP導(dǎo)致的肝中毒居2002-2003年美國藥物中毒第一位。其肝毒性是由其氧化代謝產(chǎn)物:N-乙酰對位苯醌亞胺(NAPQI)消耗谷胱甘肽(GSH),當(dāng)谷胱甘肽被消耗盡后,NAPQI即可與細胞中大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)合,從而導(dǎo)致肝毒性。APAP的肝毒性存在個體差異,可以是致死性的,也可以是短暫的可逆性的肝酶升高；而且個體間中毒劑量不同,現(xiàn)APAP中毒劑量定為4g,但也有正常劑量下APAP中毒的個例報道。有證據(jù)指出,

8、APAP的葡萄糖醛酸化代謝減弱會使APAP的肝毒性升高。因此我們關(guān)注參與APAP葡萄糖醛酸化代謝的UGT1A6,UGT1A1以及UGT1A9基因型對其代謝的影響,從一個新的角度解釋其肝毒性個體差異的因為。
　　 免疫抑制劑麥考酚酸(mycophenolic acid,MPA)是前體藥物麥考酚酸酯(mycophenolate moftil,MMF)的活性成分,它能非競爭性可逆地抑制次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶,抑制T和B淋巴細胞中嘌呤的

9、經(jīng)典合成途徑,從而抑制了淋巴細胞增殖,被廣泛應(yīng)用于腎移植以及各種自身免疫疾病的治療。麥考酚酸的藥效和不良反應(yīng)都存在明顯的個體差異,眾多研究證明此差異來自于其藥物代謝動力學(xué)而不是藥物效應(yīng)動力學(xué),因為同樣的體外孵育濃度對免疫細胞的抑制作用相當(dāng),而藥代學(xué)參數(shù)的個體差異卻有20倍左右。麥考酚酸在體內(nèi)主要由UGT1A9催化代謝為無活性的代謝產(chǎn)物葡萄糖醛酸化麥考酚酸(MPAG),由UGT2B7催化代謝為毒性代謝產(chǎn)物乙酰葡萄糖醛酸化麥考酚酸(AcMP

10、AG)。所以我們研究關(guān)注其主要代謝酶UGT1A9和UGT2B7突變對其藥代動力學(xué)的影響。在此前,因為其毒性代謝產(chǎn)物AcMPAG在人體血漿中穩(wěn)定性差且濃度低,首先需要一個非常靈敏的方法來檢測其體內(nèi)濃度。
　　 所以本研究的主要目的是首先在中國人群中了解UGT1A9.UGT1A6和UGT1A1常見突變在中國人群中的分布及連鎖情況,并利用不同的探藥來了解其體內(nèi)的功能意義。
　　 本研究取得的主要研究結(jié)果:
　　 1.在

11、較大規(guī)模的中國人群中調(diào)查了8種突變UGT1A6 T19G,UGT1A6 A541G,UGT1A6 A552C,UGT1Al-53(TA)6/(TA)7,
　　 UGT1A1 G211A,UGT1A9 C-440T,UGT1A9 CI399T,UGT2B7G221T的頻率,分別為:24.2％,22.6％,22.4％,13.4％,15.7％,3.6％,55.3％,13.3％。并對UGT1A突變進行了連鎖不平衡關(guān)系以及單倍型和二倍體的

12、分析。對452人的904條DNA鏈上UGT1A的7個突變位點進行連鎖和單倍型、二倍體分析,發(fā)現(xiàn)了22種單倍型,47種二倍體型。這些突變的分布存在明顯的種族差異,連鎖不平衡關(guān)系也存在明顯種族差異；
　　 2.UGT1A9,UGT1A6和UGT1A1的突變對口服不同劑量對乙酰氨基酚(APAP)呈現(xiàn)出不同的影響。
　　 3.UGT1A1—53(TA)6/(TA)7或UGT1A1 G211A都可以呈基因劑量效應(yīng)的升高體內(nèi)膽紅素水

13、平,升高程度在兩突變間沒有差別。但是,APAP的葡萄糖醛酸化水平與膽紅素水平在數(shù)值上并不存在明確的相關(guān)性,所以我們并不可以用膽紅素來預(yù)測APAP的葡萄糖醛酸化代謝水平。
　　 4.建立了快速檢測人血漿中麥考酚酸及其兩個代謝產(chǎn)物的超高效液相色譜(UPLC)方法,通過系統(tǒng)方法學(xué)驗證,該方法靈敏、準(zhǔn)確,適合應(yīng)用于麥考酚酸的臨床藥物代謝動力學(xué)研究。
　　 5.在單次口服給1.5g霉酚酸酯時,UGT1A9 C-440T可以升高MP

14、A的AUC,UGT1A9 CI399T可以升高MPAG的AUC,UGT2B7G211T可以升高AcMPAG以及MPAG的AUC。
　　 綜上所述,本課題首次查明了中國健康人群中UGT1A9 C-440T,UGT1A9 C1399T,UGT1A6 T19G,UGT1A6 A541G UGT1A6 A552C,UGT1A1-53(TA)6/(TA)7,UGT1A1 G211A,UGT2B7 G211T多態(tài)性的構(gòu)成和分布特征,并分析了

15、在中國健康人群中的連鎖關(guān)系和單倍體構(gòu)成；明確了UGT1A6,UGT1A1和UGT1A9遺傳多態(tài)性與不同劑量APAP的藥代動力學(xué)改變的相關(guān)性,揭示UGT1A6,UGT1A1,UGT1A9的突變可能改變APAP的葡萄糖醛酸化代謝,進而改變APAP的暴露濃度；并首次證明不同劑量APAP,UGT1A6,UGT1A1和UGT1A9的突變對APAP的藥代動力學(xué)影響存在差異。而且證實UGT1A1-53(TA)6/(TA)7和UGT1A1 G211A是