鹽藻多糖合成關(guān)鍵酶-尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶（DsUGD）基因分析及耐鹽相關(guān)性研究.pdf

1、已有研究表明多糖可以作為一種滲透調(diào)節(jié)劑和緩沖劑保護(hù)機(jī)體免受高鹽等脅迫條件對機(jī)體造成的危害。鹽藻(Dunaliella salina)是一種極端的耐鹽生物，但是對于多糖在其耐鹽中的作用及機(jī)制尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，開展鹽藻多糖相關(guān)的研究對于認(rèn)識(shí)鹽藻耐鹽機(jī)制具有重要的意義。 尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶(UDP-glucose dehydrogenase，UGD)催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)生成尿苷二磷酸葡糖醛酸(UDP

2、-glucuronic acid)，該產(chǎn)物是多糖合成中的一種最重要的前體物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室首次從鹽藻中克隆得到尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶DsUGD基因，并發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫對DsUGD基因具有明顯的誘導(dǎo)作用。在此研究基礎(chǔ)上，本研究通過高鹽脅迫下鹽藻多糖變化以及DsUGD在翻譯水平上表達(dá)差異等實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步揭示了該基因與鹽脅迫之間的關(guān)系，并探討了DsUGD基因在鹽藻耐受鹽脅迫的早期機(jī)制中的作用。本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容包括： 1、鹽脅迫下鹽藻多糖產(chǎn)量的

3、變化趨勢 通過對胞內(nèi)和胞外多糖的提取測定，結(jié)果表明胞外多糖在高鹽(3.5mol/L)脅迫下產(chǎn)量高于0.5 mol／L、1.5mol／L，條件下產(chǎn)量，并且多糖產(chǎn)量從1h開始上升，在2h達(dá)最大值，此后逐漸降低，8h達(dá)到平穩(wěn)下降趨勢；胞內(nèi)多糖含量在0～8h之間變化不大，但3.5mol／LNaCl脅迫下，鹽藻多糖含量明顯高于1.5mol/L和0.5mol／LNaCl條件下胞內(nèi)含量。這表明在外界鹽脅迫條件下，鹽藻多糖參與到機(jī)體抵制脅迫的過

4、程，為進(jìn)一步研究DsUGD基因在鹽藻中的功能打下基礎(chǔ)。 2、鹽藻多糖合成中關(guān)鍵酶DsUGD生物信息學(xué)分析 通過對DsUGD序列生物信息分析，表明該酶屬于UDP-葡萄糖/GDP-甘露糖脫氫酶家族，最大編碼框(83-1534nt)編碼483個(gè)氨基酸殘基，分子量為52.9kD，等電點(diǎn)為6.13；DsUGD序列與植物、動(dòng)物中DsUGD序列均具有較高的同源性；蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)與之前報(bào)道結(jié)果具有較好的一致性；DsUGD在N端存在一個(gè)跨

5、膜結(jié)構(gòu)域，推測其編碼的蛋白為分泌型；序列中存在四種類型的蛋白激酶作用位點(diǎn)。這些均為今后DsUGD基因功能的研究提供了參考根據(jù)。 3、DsUGD原核表達(dá)及蛋白純化 采用表達(dá)載體pET-32a、表達(dá)菌株E. coli BL21 (DE3)構(gòu)建工程菌BL21-pET32-DsUGD。工程菌在0.5mmol/LIPTG下，37℃誘導(dǎo)4h得到高效表達(dá)，分子量為70.6kD；融合蛋白DsUGD均以包涵體形式存在，通過洗滌包涵體方式純

6、化目的蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果分析包涵體純度>90％，表明目的蛋白已經(jīng)得到純化。 4、DsUGD多克隆抗體制備 采用皮下多點(diǎn)注射方法，用純化的目的蛋白做抗原免疫兔子制備DsUGD多克隆抗體。經(jīng)瓊脂糖凝膠擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測定效價(jià)為1:32，達(dá)到實(shí)驗(yàn)需要。這為Western雜交實(shí)驗(yàn)提供了前提和保障。 5、參與多糖合成的DsUGD基因與鹽藻耐鹽性的關(guān)系 Western．雜交實(shí)驗(yàn)表明，在高鹽(3.5mol/L)脅