大腸桿菌O152 O抗原基因簇中的α1,2葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因wfge的功能表征.pdf

1、大腸桿菌屬（Escherichia coli，E. coli）屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，革蘭氏陰性菌，是一種條件性致病菌，最近由大腸桿菌引起的疾病呈現(xiàn)出增加趨勢。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的重要組成部分，其在維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性以及與外界環(huán)境的相互作用中起著重要作用[1-3]。脂多糖包括類脂A、核心寡糖和O抗原三部分。其中O抗原在細(xì)菌表面抗原決定簇中具有重要作

2、用，并且也在細(xì)菌致病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此， O抗原的合成機(jī)制在研究細(xì)菌致病機(jī)理方面具有重要的作用，深入了解可以有效阻止革蘭氏陰性菌的感染。
　　O抗原重復(fù)單位合成過程中需要三類酶的參與，分別是單糖合成酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和寡糖單位處理酶。其中，糖基轉(zhuǎn)移酶在自然界中大量存在，并且糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因簇的遺傳多樣性決定了O-抗原的種類多樣性。很多O-抗原的還原性末端都是以葡萄糖酰胺(GlcNAc)作為第一個單糖，糖基轉(zhuǎn)移酶作用下加入第

3、二個糖殘基到GlcNAc的非還原性末端，以這種重復(fù)形式合成完整的O-抗原單位。然而，由于缺少合適的受體底物用于體外研究，故目前已經(jīng)研究和化學(xué)表征的糖基轉(zhuǎn)移酶非常少，因此體外條件下需要一種底物類似物用于研究糖基轉(zhuǎn)移酶途徑。本論文分以下兩部分內(nèi)容，化學(xué)法合成GlcNAc-PP-(CH2)9CH3并對其反應(yīng)條件的進(jìn)一步優(yōu)化和大腸桿菌O152抗原重復(fù)單位合成過程中相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶的研究。重點(diǎn)研究了O152抗原合成過程中的第三個糖基轉(zhuǎn)移酶WfgE的

4、功能及其底物選擇性。.
　　大腸桿菌O152中的wfge基因負(fù)責(zé)編碼一種α1,2葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。在O152抗原重復(fù)單元中，它通過α1,2糖苷鍵將葡萄糖添加到葡萄糖殘基上。wfge基因在氮端添加GST標(biāo)簽構(gòu)建融合蛋白在BL21中過表達(dá)，然后通過親和色譜法獲得純化蛋白GST-WfgE。本論文在糖基轉(zhuǎn)移酶研究中利用自制底物Glc-GlcNAc alpha-PO3-PO3-(CH2)9CH3對WfgE進(jìn)行功能表征。通過實驗證明，WfgE的

5、最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度分別是pH6.0和20℃。另外發(fā)現(xiàn)，GST-WfgE的α1,2葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性不依賴于Mn2+或者 Mg2+等的二價金屬離子。同時GST-WfgE的酶活性表現(xiàn)出了較寬的受體和供體選擇性。生物信息學(xué)氨基酸序列分析表明WfgE屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GT-B家族。本研究結(jié)果初步驗證了大腸桿菌O152中wfge基因編碼的是一種特定的UDP-Glc:Glc-GlcNAcα-二磷酸酯α1,2葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。通過對O152中wfg