24294.軟化類芽孢桿菌α環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶在大腸桿菌中的表達及其產物特異性分析

1、江南大學博士學位論文軟化類芽孢桿菌α環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶在大腸桿菌中的表達及其產物特異性分析姓名：李兆豐申請學位級別：博士專業(yè)：發(fā)酵工程指導教師：陳堅20090601摘要細胞膜透性的明顯增加。然而，甘氨酸對Ecoli細胞的生長有明顯的負面影響，這限制了重組酶生產強度的進一步提高。Ca2能補償甘氨酸對細胞生長的抑制作用，主要體現(xiàn)在單位體積中的細胞數(shù)和活細胞數(shù)明顯增加、細胞自溶明顯減少以及細胞形態(tài)修復。當TB培養(yǎng)基中同時添加150mM甘氨酸

2、和20mMCa2，誘導40h后的胞外酶活達到355U／mL，誘導36h后的最大生產強度達到O90U／mL／h，相比于只添加甘氨酸的情況均提高了50％。4重組ⅨCGT酶在C末端連有6xHistag，因此能用鎳柱進行一步親合層析，但該方法純化酶的回收率很低；重組和天然伐CGT酶能通過陰離子交換和疏水色譜兩步純化，純化酶的回收率較高。。aCGT酶在溶液中是單聚體；重組0cCGT酶環(huán)化反應的最適溫度為450C，在400C、450C和50。C下的

3、半衰期分別為8h、125h和O5h，而天然酶有稍高的最適溫度(500C)和熱穩(wěn)定性(tl／2，50。c=08h)；重組和天然酶環(huán)化反應的最適pH均為55，且分別在pH695和6～10之間相對穩(wěn)定；僅CGT酶的環(huán)化活力不依賴于金屬輔因子，H92、Ni2、Fe2和C02對環(huán)化活力有抑制作用，而一些二價金屬離子能激活環(huán)化活力，特別是Ca2、Ba2和zn2。在酶轉化的起始階段，0【CGT酶生產Ⅸ壞糊精作為主要產物，隨著反應時間的延長，p環(huán)糊精的

4、比例明顯增加，最終D環(huán)糊精為主要產物；相比于天然酶，重組酶有更高的僅環(huán)糊精特異性。僅CGT酶環(huán)化反應的動力學性質適合用Hill方程進行描述，Hill常數(shù)高于1暗示酶單聚體的底物結合有正協(xié)同作用。5。亞位點一3處的Asp372和Tyr89的突變能改變戶maceransCGT酶的環(huán)化活力和環(huán)糊精產物比例，說明這兩個殘基對環(huán)糊精產物特異性具有重要作用，也進一步證實亞位點一3對CGT酶產物特異性來講是關鍵位點。Asp372突變成賴氨酸和Tyr8

5、9突變成精氨酸顯著提高了PmaceransCGT酶的僅環(huán)糊精特異性，單突變體D372K和Y89R在產物特異性上的改變能累加于雙突變D372KJY89R；相比于野生CGT酶，雙突變體D372K／Y89R的儀環(huán)糊精產量提高了50％，而D環(huán)糊精產量下降了43％。具有更高a一環(huán)糊精特異性的突變體比野生酶更適合于僅環(huán)糊精的工業(yè)化生產。6氨基酸殘基47是定位于亞位點一3附近的主要殘基之一，不同類型的CGT酶之間殘基47的氨基酸種類明顯不同，暗示殘基