利用酵母細(xì)胞表面表達(dá)和定點(diǎn)突變提高環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物專一性.pdf

1、982659密級：分類號：093單位代碼學(xué)號∥▲東7、孳碩士學(xué)位論文10422200311358論文題目：利用酵母細(xì)胞表面表達(dá)和定點(diǎn)突變提高環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物專一性作者姓名王占坤專業(yè)微生物及分子生物學(xué)指導(dǎo)教師姓名專業(yè)技術(shù)職務(wù)祁慶生教授2006年4月18口I東大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要由于環(huán)糊精(cyclodextrin：CD)生產(chǎn)過程中，產(chǎn)物專一性不高，分離純化的難度比較大，導(dǎo)致了整個生產(chǎn)過程的復(fù)雜和生產(chǎn)成本過島。在三種環(huán)糊精中，由于Y一

2、環(huán)糊精具有更大的環(huán)，能包裹更大的客體物質(zhì)而具有更大的應(yīng)用潛能；但主要產(chǎn)y一環(huán)糊精的環(huán)糊精糖摹轉(zhuǎn)移酶(Cyclomaltodextrnglucanotransferase：CGTase；EC24I19)卻非常罕見。為了提高環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物專一性，特別是提商其產(chǎn)物中Y一環(huán)糊精的比例，本試驗(yàn)作了以下兩部分的工作。第一部分是將來Bacilluscirculansstrain251的環(huán)糊精糖摹轉(zhuǎn)移酶表達(dá)固定在酵母細(xì)胞表面，并對這種“細(xì)胞酶”

3、和純酶的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析和比較。在試驗(yàn)中將來自Bdrcu／ans25l的酶基因克隆并連接到pYDl質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入釀酒酵母EBYl00。經(jīng)免疫熒光試驗(yàn)和淀粉平板透明圈實(shí)驗(yàn)證明，環(huán)糊精糖摹轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)成功表達(dá)在酵母細(xì)胞表面。經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表達(dá)在酵母表面的環(huán)糊精糖摹轉(zhuǎn)移酶具有正常的酶活(性質(zhì)稍有改變，最佳酶活pH由6變?yōu)?)，酶反應(yīng)副產(chǎn)物葡萄糖和麥芽糖使酵母可以在以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。同時，酵母對酶的反饋抑制物一葡萄糖和麥芽糖的利用也促

4、進(jìn)了環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化，而且酵母發(fā)酵產(chǎn)生的灑精可以和環(huán)糊精形成包合物進(jìn)一步推動了反戍的正向進(jìn)行。酵母細(xì)胞酶的酶活達(dá)到1嬲U／ml，底物轉(zhuǎn)化率為465％，而在酵母生長、產(chǎn)生酒精的條件下環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率町以達(dá)到60％。另外產(chǎn)物中B一環(huán)糊精的比例從64％上升到75％，方便了產(chǎn)物的純化。第二部分足以來自ThermoanaerobacteriumthermosulfurigenesEMl的耐熱環(huán)糊精糖草轉(zhuǎn)移酶為母板，進(jìn)行產(chǎn)物特異性的改造。首先將三種Y一環(huán)

5、糊精糖皋轉(zhuǎn)移酶與其它11一環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶和B一環(huán)糊精糖摹轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行氨皋酸序列的比對，發(fā)現(xiàn)了兩段Y一環(huán)糊精糖摹轉(zhuǎn)移酶所特有的氨摹酸；然后找出酶基因中的相應(yīng)的堿攘序列。實(shí)驗(yàn)中利用不對稱PCR的方法，將這兩段特異的DNA置換到母板酶基因的相應(yīng)位置。這曲段氨牲酸序列在三種y一環(huán)糊貓?zhí)巧D(zhuǎn)移酶中略有不同，具體到試驗(yàn)中采用的是來Bacillusclarkii7364的氨皋酸序列。同時試驗(yàn)中還做了對曲段基因的單獨(dú)分別改造以及酶的表達(dá)。對改造后的酶進(jìn)