肝癌細(xì)胞內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)與其細(xì)胞膜表面糖鏈相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　 細(xì)胞表面糖復(fù)合物在細(xì)胞識(shí)別、黏附、通信聯(lián)絡(luò)、免疫應(yīng)答等方面起著重要作用。細(xì)胞表面糖復(fù)合物的糖鏈結(jié)構(gòu)的異常變化與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程緊密相關(guān)。研究這些受時(shí)間和空間調(diào)控的聚糖表達(dá)模式，對(duì)了解聚糖在癌變過(guò)程中所起的作用有著重要的意義。
　　 在本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，運(yùn)用凝集素芯片對(duì)正常小鼠以及肝癌模型鼠細(xì)胞膜表面糖鏈表達(dá)情況進(jìn)行高通量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞膜糖鏈的種類(lèi)和數(shù)量都發(fā)生了改變，唾液酸、乙酰半乳糖

2、、巖藻糖、甘露糖類(lèi)型糖鏈表達(dá)增加。
　　 糖鏈?zhǔn)窃谔腔邮荏w、供體和糖基轉(zhuǎn)移酶共同作用下完成，不是基因直接編碼的產(chǎn)物，而是由基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，后者再合成糖鏈。既然糖鏈的合成是通過(guò)一系列定位有序的糖基轉(zhuǎn)移酶完成的，糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)差異將直接導(dǎo)致糖鏈結(jié)構(gòu)的變化，因此從糖基轉(zhuǎn)移酶入手可以從本質(zhì)上闡明糖鏈在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的變化規(guī)律及調(diào)控作用。
　　 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類(lèi)基因組中至少有250種糖基轉(zhuǎn)移酶，其中唾液酸轉(zhuǎn)移酶有21種

3、，半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶有14種，巖藻糖轉(zhuǎn)移酶有13種，每種糖基轉(zhuǎn)移酶作用的底物和催化反應(yīng)后的產(chǎn)物也不盡相同，究竟是哪些糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)腫瘤細(xì)胞膜糖鏈表達(dá)改變有貢獻(xiàn)目前尚不清楚。
　　 本課題針對(duì)目前糖基轉(zhuǎn)移酶的研究現(xiàn)狀和結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的前期研究工作，對(duì)小鼠正常肝細(xì)胞系BNL CL.2與癌變肝細(xì)胞系Hepa1-6，正常小鼠肝與肝癌模型鼠細(xì)胞膜糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，并與其細(xì)胞膜表面糖鏈表達(dá)進(jìn)行比對(duì)分析，分析肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞膜糖鏈

4、的表達(dá)與糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的相互關(guān)系，為探討糖基轉(zhuǎn)移酶在肝癌的發(fā)生過(guò)程中可能參與的機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、小鼠肝癌模型的建立
　　 將40只C57雄性小鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組飼以含DEN飲水，對(duì)照組常規(guī)飲水。12周后取肝臟標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡顯微鏡下觀察。
　　 2、凝集素芯片檢測(cè)細(xì)胞膜糖鏈
　　 (1)提取細(xì)胞系及小鼠肝組織細(xì)胞；
　　 (2)

5、取上述收集的細(xì)胞懸液，吖啶橙染色進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記；
　　 (3)將熒光標(biāo)記的細(xì)胞懸液滴加到凝集素芯片上進(jìn)行細(xì)胞孵育;
　　 (4)GeneTACTMLSIV激光掃描儀掃描，對(duì)細(xì)胞膜糖鏈檢測(cè)；
　　 (5)根據(jù)糖鏈增加情況篩選糖基轉(zhuǎn)移酶。
　　 3、應(yīng)用RT-PCR方法，對(duì)小鼠正常肝細(xì)胞系BNL CL.2與癌變肝細(xì)胞系Hepa1-6，正常小鼠肝與肝癌模型鼠肝細(xì)胞糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　 4、測(cè)

6、定灰度值，各目的基因的灰度與管家基因灰度值的比值用于比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因表達(dá)量的差異，用以分析糖基轉(zhuǎn)移酶與糖鏈之間的相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、建立小鼠肝癌模型
　　 在實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)組第12周開(kāi)始死亡，死亡8只，剩余12只小鼠，處死后取出肝臟，其肝臟表面粗糙不平，呈現(xiàn)顆粒狀。肝臟的切面可看見(jiàn)灰白色顆粒狀的結(jié)節(jié)，石蠟包埋切片HE染色后，

7、鏡下觀察，肝組織均發(fā)生癌變，
　　 2、芯片掃描結(jié)果
　　 對(duì)照凝集素糖鏈親和特異性，可以看出肝癌細(xì)胞系Hepa1-6與肝正常細(xì)胞系BNLCL.2相比，細(xì)胞膜表面糖鏈增加了唾液酸，葡萄糖、乙酰葡萄糖、半乳糖、乙酰半乳糖、甘露糖、巖藻糖糖鏈；肝癌小鼠與正常小鼠相比，細(xì)胞膜表面糖鏈增加了上增加了細(xì)胞膜上增加了唾液酸、乙酰葡萄糖、乙酰半乳糖、甘露糖、巖藻糖和半乳糖糖鏈。
　　 3、糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA擴(kuò)增結(jié)果
　　

8、 為了分析糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)跟細(xì)胞膜糖鏈表達(dá)的相關(guān)性，根據(jù)凝集素芯片檢測(cè)結(jié)果，本課題選取18種糖基轉(zhuǎn)移酶，包括巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Fut8和α-1，3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Fut4;唾液酸轉(zhuǎn)移酶st3gal家族6個(gè)成員st3gal1-6，st6gal家族2個(gè)成員st6gal1-2和St6galnac6;半乳糖基轉(zhuǎn)移酶β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族中的4個(gè)成員B4galt3-6，a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族中的B3galt2，N

9、-乙酰乳糖胺-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ggta1和Galnt6等，應(yīng)用PT-PCR方法對(duì)其mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)論：
　　 本課題應(yīng)用凝集素芯片檢測(cè)了小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6、正常肝細(xì)胞系BNL CL.2、正常小鼠肝與肝癌模型鼠細(xì)胞膜表面糖鏈表達(dá)譜，對(duì)照凝集素糖鏈親和特異性，可以看出肝癌細(xì)胞系與肝正常細(xì)胞系相比，細(xì)胞膜表面糖鏈增加了唾液酸，葡萄糖、乙酰葡萄糖、半乳糖、乙酰半乳糖、甘露糖、巖藻糖糖鏈；肝癌小鼠與正常

10、小鼠相比，細(xì)胞膜表面糖鏈增加了上增加了細(xì)胞膜上增加了唾液酸、乙酰葡萄糖、乙酰半乳糖、甘露糖、巖藻糖和半乳糖糖鏈。
　　 對(duì)唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族，半乳糖轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族中的18種糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族中St3gal1、St3ga14、St3ga16在肝癌細(xì)胞膜表面顯著高表達(dá)；半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族中B4galt3和Ggtal在小鼠模型肝細(xì)胞膜表面顯著高表達(dá)；巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族中Fut4和F