酶母菌表面展示果糖基轉(zhuǎn)移酶及蔗果三糖的制備研究.pdf

1、低聚果糖（Fructooligosaccharides，F(xiàn)OS）是指在蔗糖分子的果糖基上連接1-3個果糖基而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。FOS作為一種益生元，能刺激腸道中雙歧桿菌生長，抑制外源致病菌和腸內(nèi)固有腐敗菌的生長繁殖，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，提高機(jī)體免疫等功效。其中蔗果三糖是低聚果糖中益生功效最強(qiáng)的成分。植物來源蔗糖:蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶(sucrose: sucrose1-fructosyltransferase，

2、1-SST)特異性地催化2分子的蔗糖轉(zhuǎn)化成1分子蔗果三糖和1分子葡萄糖。表面展示技術(shù)是將目的多肽或蛋白以化學(xué)鍵連接到細(xì)胞表面，并且被展示的外源多肽或蛋白保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，具有固定化酶的優(yōu)良性狀。本研究擬將植物來源的1-SST基因通過表面展示技術(shù)導(dǎo)入酵母菌中，并在其表面表達(dá)蛋白，利用微生物繁殖快的特點來解決植物中1-SST酶量少、低聚果糖產(chǎn)量低的缺點，實現(xiàn)重復(fù)利用重組菌生產(chǎn)蔗果三糖，并對1-SST的酶學(xué)性質(zhì)及影響蔗果三糖產(chǎn)

3、量的相關(guān)因素進(jìn)行優(yōu)化。
　　首先，將植物來源的1-SST基因通過表面展示技術(shù)在解脂亞羅酵母菌表面進(jìn)行展示，構(gòu)建基因工程菌。經(jīng)PCR檢測表明該基因確已整合到酵母菌基因組中，經(jīng)免疫熒光檢測表明該重組1-SST已展示到了重組菌的細(xì)胞表面上，經(jīng)高效液相檢測表明表達(dá)蛋白1-SST酶體外轉(zhuǎn)化蔗糖反應(yīng)的產(chǎn)物為蔗果三糖。
　　然后，對發(fā)酵該重組菌的培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提高重組菌的產(chǎn)酶能力。重組菌培養(yǎng)基單因素實驗

4、的優(yōu)化結(jié)果為:最適碳源為蔗糖，其最適濃度為2％;最適氮源為酵母提取物，其最適濃度為0.25％;氯化銨最適濃度為0.2％，最適pH值為5.5，最適接種量為5×107 cells，最佳裝液量為50 mL。在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面方法對重組菌培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)化。PB實驗篩選出酵母提取物、氯化銨、接種量為主效應(yīng)因子;最陡爬坡實驗確定中心點及最優(yōu)值取值范圍;中心組合實驗確定了最優(yōu)培養(yǎng)基配方:蔗糖濃度2％、NH4Cl濃度0.134％、酵母提取物濃度0.1

5、67％、pHS.5、KH2PO40.032％、接菌量3.15×107cells。培養(yǎng)基優(yōu)化后，1-SST重組酶活性達(dá)46.67 U/mL，比優(yōu)化前的提高了1.66倍。2L發(fā)酵罐實驗研究表明其最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵溫度為25℃，攪拌速度為400 rpm，充氣量為3 L/min，此時發(fā)酵罐培養(yǎng)的重組菌酶活力可達(dá)37.2 U/mL。
　　另外，對表面展示1-SST粗酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了單因素實驗研究，結(jié)果表明:重組酶反應(yīng)的最適溫度為45

6、℃，40℃下保溫180 min剩余酶活為70％，60℃下保溫180 min酶活僅剩余18％;最適pH值為7.5; Ca2+和Al3+離子對酶活有促進(jìn)作用，1mM濃度的Cu2+對酶活有促進(jìn)作用，10mM濃度Cu2+對酶活有抑制作用，而Zn2+對酶活有很強(qiáng)的抑制作用。
　　最后，利用響應(yīng)面法對表面展示重組1-SST轉(zhuǎn)化蔗糖制備蔗果三糖的條件進(jìn)行了實驗，研究表明:pH值、底物濃度、反應(yīng)溫度對反應(yīng)影響都極為顯著，最適體外反應(yīng)條件為pH值9