米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT基因的原核和真核表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、果糖基轉(zhuǎn)移酶具有轉(zhuǎn)糖基作用，是能夠催化果糖基單元從一個(gè)蔗糖分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)蔗糖的一類酶。三氯蔗糖是人類開(kāi)發(fā)的一種最完美的強(qiáng)力甜味劑，蔗糖-6-乙酸酯在三氯蔗糖合成中非常重要。生物酶法合成蔗糖-6-乙酸酯成為近年來(lái)研宄的熱點(diǎn)，果糖基轉(zhuǎn)移酶可以以蔗糖與葡萄糖-6-乙酸酯為底物，催化合成蔗糖-6-乙酸酯。該方法具有高效性、專一性、且副產(chǎn)物較少等優(yōu)點(diǎn)，因此有極大的應(yīng)用潛力。
　　在前期試驗(yàn)中，我們從米曲霉ZZ-01發(fā)酵液的中篩選到一種新型

2、的果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT，并且發(fā)現(xiàn)該酶能夠催化合成蔗糖-6-乙酸酯的。本研宄首先將來(lái)自米曲霉中表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT的基因在大腸桿菌中表達(dá)，然后對(duì)大腸桿菌表達(dá)的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研宄。由于大腸桿菌是胞內(nèi)表達(dá)體系，產(chǎn)物分離純化步驟較為復(fù)雜，我們又將米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT的基因在畢赤酵母中克隆表達(dá)，并對(duì)畢赤酵母表達(dá)的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研宄，對(duì)比分析畢赤酵母與大腸桿菌不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的米曲霉果糖基

3、轉(zhuǎn)移酶AoFT酶學(xué)性質(zhì)的差異，通過(guò)分析畢赤酵母表達(dá)的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT糖基化位點(diǎn)的不同，解釋酶學(xué)性質(zhì)變化的原因。
　　具體研宄內(nèi)容如下：
　　(1)通過(guò)RACE-PCR的方法，從米曲霉ZZ-01中克隆到果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT基因，并分析果糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列的特性。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b-AoFT，將重組質(zhì)粒pET22b-AoFT轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建工程菌，利用IPTG誘導(dǎo)，使目的蛋白表達(dá)，收集

4、菌體并經(jīng)過(guò)超聲破碎、離心和鎳柱親和層析純化等分離純化蛋白，得到目的蛋白，然后進(jìn)行酶活力的測(cè)定。
　　(2)米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT的催化特性研究。包括最適反應(yīng)溫度、最適pH和熱穩(wěn)定性，以及金屬離子、有機(jī)溶劑、表面活性劑、還原劑和蛋白抑制劑等對(duì)米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT活性的影響。
　　(3)將重組質(zhì)粒pET22b-AoFT雙酶切獲得AoFT基因，并與pPICAαA質(zhì)粒構(gòu)成pPICAαA-AoFT重組質(zhì)粒，經(jīng)如Sac I酶切

5、線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中，得到X33工程菌，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，收集發(fā)酵液并經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀和鎳柱親和層析等步驟純化獲得目的蛋白，然后進(jìn)行酶活力測(cè)定。
　　(4)對(duì)比分析畢赤酵母與大腸桿菌不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT酶學(xué)性質(zhì)的不同(溫度，pH等）；通過(guò)分析畢赤酵母表達(dá)的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT糖基化位點(diǎn)的不同，解釋酶學(xué)性質(zhì)變化的原因。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
　　(1)重組基因工程菌E.coli B

6、L21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能夠表達(dá)目的蛋白酶米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT，SDS-PAGE結(jié)果顯示該目的蛋白分子量約68KDa,與預(yù)期結(jié)果相符，純化回收率達(dá)到33.6％，比活力為65.8U/mg。
　　(2)大腸桿菌表達(dá)的米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別為50℃和6.0。在溫度范圍30-50℃處理1小時(shí)可以保持80%以上活性；果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT還具有較髙的pH穩(wěn)定性，在pH5.0-7.0之間處理1小時(shí)可以保持80

7、%活性以上。此外，該酶對(duì)大多數(shù)的金屬離子、表面活性劑(Tween20、Triton-X100)和有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、甲醛、DMF、DMSO等）具有較好的抗性。變形劑SDS和尿素對(duì)該酶活性抑制作用較強(qiáng)，但是該酶轉(zhuǎn)糖基活性不受EDTA抑制，表明該酶不是金屬酶。
　　(3)重組基因工程菌X33經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT,SDS-PAGE結(jié)果顯示該目的蛋白分子量約90KDa,純化回收率達(dá)到70.6%，比活力為71.

8、41U/mg。該酶最適反應(yīng)溫度為45℃，在20-60℃范圍內(nèi)，熱處理1h后該酶仍保持50%以上的活性；最適pH為5.5，且在pH4.0-7.0范圍內(nèi)相對(duì)酶活均在60%以上。大多數(shù)金屬離子、常見(jiàn)表面活性劑和EDTA對(duì)酶活影響不明顯，并且該酶對(duì)有機(jī)溶劑有較好的抗性。此外，還原劑DTT對(duì)酶活性有抑制作用，且濃度越大抑制作用越強(qiáng)；高濃度的酶抑制劑對(duì)該酶具有較強(qiáng)的抑制作用。
　　(4)來(lái)自畢赤酵母表達(dá)的果糖基轉(zhuǎn)移酶AoFT比來(lái)自大腸桿菌表達(dá)