蔗糖果糖基轉(zhuǎn)移酶基因SST1轉(zhuǎn)入番茄的研究.pdf

1、蔗果寡糖是寡糖中非常重要的一類，廣泛存在于洋蔥、香蔥、牛蒡、菊芋、香蕉、小麥、黑麥、燕麥中，形式多種多樣。其中菊粉中的蔗果寡糖的含量最豐富，占塊莖干重70％-80％。天然存在的蔗果寡糖是由微生物或植物中具有果糖基轉(zhuǎn)移活性的酶作用而產(chǎn)生的。目前生產(chǎn)的蔗果寡糖是將微生物中呋喃苷酶或果糖轉(zhuǎn)移酶作用于蔗糖而制備獲得。蔗果寡糖是超強(qiáng)雙歧因子，能促進(jìn)雙歧桿菌增殖，而雙歧桿菌是典型的有益菌，它可促進(jìn)消化吸收，合成多種維生素，促進(jìn)腸蠕動，分泌乳酸，抑制

2、某些有害菌生成，防止便秘，增強(qiáng)人體免疫力等諸多功能。且攝入蔗果寡糖不會引起血糖值和胰島素升高，對受胰島素控制的肝糖原的合成也無影響，可以作為糖尿病和高血壓患者的保健甜味劑。而人體內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)目隨著年齡的增長，環(huán)境污染及抗生素的使用等原因，含量逐漸下降。僅從維持腸道中微生物區(qū)系平衡出發(fā)，就應(yīng)該人為地補(bǔ)充雙歧桿菌。既然蔗果寡糖可以預(yù)防和調(diào)節(jié)多種疾病，并且對人體沒有任何毒副作用，被認(rèn)為營養(yǎng)型保健食品，已被許多國家批準(zhǔn)使用于食品、化妝品、藥品

3、、飼料等。因此，可以通過加強(qiáng)蔗糖果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)來提高番茄果實(shí)中蔗果寡糖含量，培育出的富含蔗果寡糖的番茄果實(shí)具有很好的食用價值和發(fā)展前景。 本研究以多代自交番茄品系(LycoperciconesculentumMill.)為實(shí)驗(yàn)材料，用10％的次氯酸鈉消毒后培育無菌番茄苗，然后篩選出抗卡那霉素的最佳芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)基因植株生根培養(yǎng)基，建立番茄高頻再生轉(zhuǎn)化體系。通過基因重組技術(shù)構(gòu)建了含有蔗糖果糖基轉(zhuǎn)移酶基因SST1表達(dá)載

4、體pVCT-35SST,采用凍融法將SST1基因直接導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，并且通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，獲得了蔗果寡糖轉(zhuǎn)基因番茄植株，轉(zhuǎn)化植株在40mg·L-1Kan生根培養(yǎng)基中生根良好，PCR鑒定擴(kuò)增出所需要的目標(biāo)帶，證明目的基因已經(jīng)整合到基因組中。主要研究結(jié)果如下： 1.建立了番茄的離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系確定了適宜再生培養(yǎng)的外植體為番茄子葉，最佳芽分化培養(yǎng)基為MS+2.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1IAA

5、，最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.3mg·L-1IAA，適宜的芽分化卡那霉素抗性篩選壓為Kan50mg·L-1。當(dāng)農(nóng)桿菌菌液OD值在0.3～0.5之間用液體MS培養(yǎng)基重懸后，最適合用來浸染番茄外植體。 2.構(gòu)建了蔗糖果糖基轉(zhuǎn)移酶基因SST1的雙元植物基因表達(dá)載體將來源于菊芋的SST1基因由35S啟動子和nos終止子控制，插入載體pVCT2020中，構(gòu)建成含有35S-SST1-Tnos基因表達(dá)盒的雙元植物基因表達(dá)載體。經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切