苯基-瓊脂糖疏水層析介質(zhì)的制備及其對(duì)果糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化.pdf

1、疏水層析是目前生物大分子分離純化中廣泛應(yīng)用的操作技術(shù)。其分離過程具有操作簡便、設(shè)備簡單、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。疏水層析介質(zhì)是該技術(shù)的核心要素，制約著疏水層析效果的優(yōu)劣。國內(nèi)主要使用進(jìn)口疏水層析介質(zhì)，價(jià)格較高。因此制備低成本，高效率的疏水層析介質(zhì)也日益被提上日程。本論文以瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B作為基質(zhì)，對(duì)苯基-瓊脂糖（Phenyl-Sepharose CL-6B）疏水層析介質(zhì)的活化偶聯(lián)以及直接偶聯(lián)制備工藝進(jìn)行研究。
　　

2、在活化偶聯(lián)法制備Phenyl-Sepharose CL-6B疏水層析介質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，所得最佳活化條件為：二甲基亞砜（DMSO）28 mL/g，環(huán)氧氯丙烷（ECH）14.4 mL/g，反應(yīng)溫度35℃，反應(yīng)時(shí)間2.0 h。環(huán)氧基密度最高可達(dá)0.881μmol/mg干膠。對(duì)活化所得瓊脂糖凝膠進(jìn)行配基偶聯(lián)工藝探索，所得偶聯(lián)反應(yīng)的最佳條件為：NaOH19.84 mmol/g，苯酚4mL/g，反應(yīng)溫度50℃，水浴反應(yīng)時(shí)間為4 h。配基密度最高可達(dá)0.

3、707μmol/mg干膠，配基偶聯(lián)率為80.24％。在直接偶聯(lián)法制備 Phenyl-Sepharose CL-6B疏水層析介質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，最佳反應(yīng)條件為：苯基縮水甘油醚0.5 mmol/g，三氟化硼乙醚220μL/g，溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間50 min。所得配基密度可達(dá)1.059μmol/mg干膠。
　　為考察自制疏水層析介質(zhì)Phenyl-Sepharose CL-6B的化學(xué)穩(wěn)定性，分別將兩種途徑制備所得的介質(zhì)置于蒸餾水、80%乙醇、

4、2 mol/L氯化鈉、6 mol/L尿素和2 mol/L硫酸銨溶液中，經(jīng)過30天后，介質(zhì)的配基密度雖有下降，但降幅較小，與之前的配基密度基本無異。保存在乙醇、NaCl、尿素和硫酸銨溶液中的介質(zhì)與保存在水中的介質(zhì)吸附等溫線無明顯差異，說明自制疏水層析介質(zhì) Phenyl-Sepharose CL-6B的化學(xué)穩(wěn)定性良好。介質(zhì)的紅外光譜圖顯示，反應(yīng)后的介質(zhì)在1598 cm-1、1495 cm-1以及1497 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)的特征吸收峰，表明

5、Sepharose CL-6B介質(zhì)已偶聯(lián)上苯基。
　　用自制的疏水層析介質(zhì)Phenyl-Sepharose CL-6B對(duì)果糖基轉(zhuǎn)移酶粗酶液進(jìn)行分離純化，以表征該介質(zhì)的分離性能。首先對(duì)發(fā)酵所得的解脂耶羅維亞酵母菌上清液（即粗酶液，活力為2.94 IU/mL，比活力為0.16 IU/μg）進(jìn)行硫酸銨鹽析，在65%的硫酸銨飽和度下鹽析所得酶活力為76.94 IU/mL，比活力為0.19 IU/μg，活力回收率達(dá)95.67%。隨后用自制的

6、疏水層析介質(zhì)對(duì)鹽析所得酶液進(jìn)行分離，考察了不同 pH，硫酸銨濃度，徑高比，上樣量和流速下，兩種介質(zhì)對(duì)果糖基轉(zhuǎn)移酶的分離效果，確定了用自制疏水層析介質(zhì)純化果糖基轉(zhuǎn)移酶的最適條件。結(jié)果表明，在 pH6.5，硫酸銨濃度2.3mol/L，高徑比12，上樣量0.5 mL，流速1 mL/min的情況下，兩種介質(zhì)均可達(dá)到較好的分離效果。最后，用上述條件對(duì)果糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了分離純化，洗脫峰的活力為6.45 IU/mL，比活力為1.09 IU/μg，其活