谷胱甘肽親和層析介質(zhì)制備及其對(duì)蛋白的純化.pdf

1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合表達(dá)系統(tǒng)是通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行蛋白表達(dá)、純化和檢測(cè)的重要系統(tǒng)。此系統(tǒng)表達(dá)的蛋白一般在N末端融合上可溶性谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶作為標(biāo)簽。由于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與谷胱甘肽能夠特異性的結(jié)合，因此可以通過(guò)谷胱甘肽親和層析介質(zhì)對(duì)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化。以瓊脂糖凝膠4 FF為基質(zhì)，1，4-丁二醇二縮水甘油醚為活化劑，通過(guò)活化、偶聯(lián)谷胱甘肽(GSH)，優(yōu)化活化及偶聯(lián)條件，得到GSH親和層析介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2、明:活化及偶聯(lián)的優(yōu)化條件為10mL基質(zhì)加入0.42g NaOH，15mL DMSO，15mL BDGE，反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間為6h。在此條件下，環(huán)氧基修飾密度可達(dá)60-65μmol/mL;當(dāng)偶聯(lián)溶液pH6.5時(shí)，所制備的自制介質(zhì)載量可達(dá)14.19±0.98mg/mL。以此介質(zhì)對(duì)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶及融合蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果表明該介質(zhì)純化效果較好、穩(wěn)定性較搞，可重復(fù)使用。
　　丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogena

3、se，EC l.4.1.1)是一種以煙酰胺腺嘌呤(NAD+)為輔酶的氨基酸脫氫酶，可逆催化丙氨酸的氧化脫氨反應(yīng)生成丙酮酸，氨以及NADH。晶體結(jié)構(gòu)解析酶蛋白空間結(jié)構(gòu)為深入闡述酶的催化機(jī)理提供更為有利的條件。本文以巨大芽孢桿菌WSH-002菌株（Bacillus.Megaterium WSH-002，GenBank No.345442329）基因組為模版，將目的基因克隆到表達(dá)載體，得到重組質(zhì)粒pET-28a-Ald、pGEX-6P-1/A

4、ld，并分別轉(zhuǎn)入到BL21(DE3)，IPTG低溫誘導(dǎo)后均為大量可溶性表達(dá)。菌體上清液分別經(jīng)商業(yè)鎳柱、自制GSH層析柱和尺寸排除色譜純化后均獲得高純度的Aid WSH-002蛋白。對(duì)高純度蛋白采用晶體生長(zhǎng)試劑盒篩選初步結(jié)晶條件并優(yōu)化。蛋白濃度為12mg/mL，結(jié)晶溶液為0.03 M檸檬酸pH7.5，16％(w/v) PEG3350時(shí)，晶體衍射率為2.22(A)屬于三方晶系;蛋白濃度15mg/mL，結(jié)晶溶液為0.1 M HEPES pH8